Quel modèle animal ?

1. Quel modèle animal ?

2. Quelle mesure fonctionnelle ?

3. L’épithélium respiratoire trachéo-bronchique: • histologie (rappels) • rôles • physiopathologie de l’asthme

4. EPITHELIUM RESPIRATOIRE • continu (complexes jonctionnels) • de type cilié • de hauteur variable pseudostratifié Tr / Br unistratifié br distales

5. EPITHELIUM RESPIRATOIRE 8 types cellulaires situation basale •C. basales •C. Kultschitsky situation superficielle •C. ciliées C. non ciliées sécrétrices • C. à mucus • C. Clara non sécrétrices • C. intermédiaires • C. en brosse • C. mixtes: ciliées et à mucus

6. CELLULES CILIÉES • prédominantes (1 c. à mucus / 5 c. ciliées) • prismatiques avec cils vibratils • noyau basal • mitochondries apicales ++ associées aux corpuscules basaux CELLULES à MUCUS • prismatiques, évasées (cellules caliciformes) • grains de sécrétion grands, floculeux, riches en • glycoprotéines de haut PM(mucines)responsables de la • viscoélasticité du mucus • sécrétion accrue et accélérée en cas d'agression • prolifèrent en cas d'agression chronique • progénitrices des C. ciliées

7. CELLULES en BROSSE • dépourvues de cils • microvillosités apicales • corpuscules basaux, parfois cellules immaturesimpliquées dans la régénération de l'épithélium

8. CELLULES SÉREUSES • épithélium respiratoire fœtus, rat • épithélium des glandes trachéobronchiques + CELLULES BASALES • cellules ovoïdes reposant largement sur la membrane basale • assurent l'ancrage de l'épithélium respiratoire par des: - hémidesmosomes (face basale) - desmosomes (faces latérales) • nombre corrélé à la hauteur de l'épithélium

9. CELLULES INTERMÉDIAIRES • cellules indifférenciées • progénitrices des autres cellules épithéliales • responsables de l'aspect pseudostratifié de l'épithélium respiratoire (intercalées entre les autres types cellulaires sans atteindre la basale ni la lumière)

10. EPITHELIUM BRONCHIOLAIRE • cellules basalespeu nombreuses, absentes dans les zones distales • cellules ciliées • cellules à mucusprogressivement remplacées par: • cellules de Clara

15. L’éotaxine est produite par les cellules épithéliales mais pas seulement!

16. Epithélium respiratoire et immunité • Cellules présentatrices de l’Ag: monocytes/macrophages, cellules dendritiques/Langerhans • Lymphocytes T, B • Polynucléaires neutrophiles, éosinophiles, basophiles/mastocytes

17. EPITHELIUM RESPIRATOIRE et IMMUNITÉ - à l'état normal: • existence de lymphocytes intraépithéliaux ou regroupés en structures organisées associées aux bronches (BALT: chez le rongeur) • présence de c. de Langerhans intraépithéliales • expression épithéliale des molécules de classe II en pathologie:infiltration accrue par Ly au cours des réponses immunitaires et inflammatoires, développement des BALT lors d'infections bronchiques, expression augmentée des classe II dans asthme et rhinite allergique

18. Physiopathologie de l’asthme

19. Les lymphocytes « TH1, TH2 »

20. Asthme et réponse TH2

21. L’éosinophile dans l’asthme

22. Eosinophil-derived proteins

23. Le mastocyte dans l’asthme Entretien de l’inflammation

24. La bronche de l’asthmatique

25. Agression et inflammation Liens mésenchyme - épithélium Activation épithéliale Activation des fibroblastes

26. Deux types de réponse à l’agression chronique: l’inflammation chronique ou le remodelage Agression Myofibroblastes transitoires Inflammationaiguë répétée cicatrisation Remodelage (Épaississement MB, hypertrophie cml…) Inflammation chronique à éosinophiles switch? maladie Symptômes Altérations fonctionnelles Insensible aux corticoïdes ? Corticoïdes sensible

27. Asthme : épidémiologie • Prévalence de 5.8 % en février 2000 • En France (1998) : 3.5 M d’asthmatiques • Mortalité: 4/100 000 hab./an en France (1990) • 2000 morts/an en France (2001)

28. Physiopathologie de l’obstruction bronchique dans l’asthme HYPERREACTIVITE OBSTRUCTION INFLAMMATION • Stimulation du SN végétatif

29. Asthme et modèles animaux - Evaluation de la mécanique respiratoire des rongeurs - Choix des modèles animaux - Modèles animaux d’hyperréactivité bronchique

30. Evaluation de la mécanique respiratoire chez la souris (1) 1) Techniques nécessitant la « bipneumonectomie » • Mesure de la contraction de segments isolés des voies aériennes : étude de la réponse contractile isométrique ou isotonique (soluté physiologique -transducteur de force ou mouvt): mediateurs contractiles ou stim électrique des CML - : secretions in vivo (étude de le contraction musc seule) innervation et circulation bronchique non étudiées + : trachée isolée sensibilisée Ag plus réactive que trachée contrôle donc la contractilité de la CML intervient dans l’HRB

31. Evaluation de la mécanique respiratoire chez la souris (2) • Mesure du volume de gaz piégé : souris: seul le poumon (Pel) influence la CRF (pas la paroi thoracique) tonus des VA, certaines VA peuvent être fermées à la CRF si BC   vol air piégé (trapping) mesuré par principe d ’Archimède + : facile, état in vivo à l’euthanasie, rés. id metach A/J vs C3H/HeJ - : 1 mesure/souris, relation obstruction VA gaz trappé ? (petites VA) • Mécanique sur poumon isolé volume, débit, pr transpulm  compliance statique et dyn, résistance non utilisé pour les tests de BC (fermeture hétérogène des VA)

32. Evaluation de la mécanique respiratoire chez la souris (3) 2) Techniques nécessitant l’anesthésie et l’intubation +: exclut les VAS (résistance); contrôle de la FR et du mode ventilatoire respect innervation, mesures répétées (<6h), effets cellulaires et bioch -: effets des anesthésiques (neuro, vascul, agoniste/antagoniste récepteurs) • Pression des VA lors de la ventilation VT et FR fixes, profil P/t modif par stim BC (Airway Pressure Time Index) +: simple -: mesure globale de l ’impédance respiratoire(RVA? Compliance pulm?) • pression d’occlusion Rr = Pr /débit Cr = V/P(fin occlusion - CRF) +: modif isolée Rr = grosses VA et modif isolée Cr = petites VA -: mesure Rr inspiratoire, interruption de la ventilation

33. Enregistrement de la pression trachéale chez l’animal anesthésié (VT et FR fixes) Pb: variations de RVA et/ou élasticité pulmonaire

34. Evaluation de la mécanique respiratoire chez la souris (4) • Mesure de la résistance et de la compliance dynamique VT , débit, pression transpulmonaire PTP = débit x Rpulm + VT / Cdyn PTP = P trachéale - P pleurale (thoracotomie bilatérale, EEP>Patm) V pléthysmographie; PTP et VT en phase +: enregistrement continu Rpulm et Cdyn -: techniquement difficile • Mesure de la résistance et de la compliance avec capsules alvéolaires 3) Techniques non invasives +: même animal ,mesures répétées -: chgt de l’ouverture de la glotte, résistance nasale  modif R resp • oscillations forcées (Po/débit=R) P oscill surface corporelle  mesure de débit généré à l’ouverture des VA -:FR élevée, masque nasal modifie le contrôle neurol ventilatoire • Plethysmographie inspir  réchaufft de l’air modif P mesurées lors du cycle ventilatoire

35. Plethysmographie

36. Calcul de la pause et de la pause augmentée (Penh) Pause = (Te – Tr) / Tr Penh = PEP/PIP x (Te – Tr) / Tr NB: Pas d’interférence avec les R des VAS des rongeurs

37. Augmentation de la Penh après provocation à la metacholine

38. Modèles animaux et asthme (1) • Pas d’asthme allergique dans le monde animal Depuis 1990 nombreuses publications décrivant des modèles de maladies allergiques (pour le développement de nouvelles molécules pharmaceutiques) … chaque modèle ± avantage mais  de la maladie humaine • Mécanisme exploré 1) Réponse précoce : bronchospasme aigü - Pas de modèle murin, rare chez le rat (Donryu>Wistar) - Cobaye +++ : OVA /conscient ou anesthésié/ fr,Vt, Rl, Cdyn /ip, iv, sc, im, po - Bronchospasme levé par 2 agonistes, antimuscariniques, anti-H1 chez cobaye homme / ± antagoniste des LT, inhib des PDE

39. Modèles animaux et asthme (2) 2) Réponse tardive - souris ? / Rat Brown Norway (OVA) - cobaye (OVA ip puis inhalé  B/C 17 à 24h + eosino) - lapin, mouton, chien, cochon ± metapyrone, singe (ascaris) PAS DE MODELE D’INFLAMMATION CHRONIQUE DES VOIES AERIENNES 3 ) Hyperréactivité bronchique Aptitude des VA à répondre à des stimuli bronchoconstricteurs

40. Différents modèles animaux utilisés

41. Modèles animaux d’hyperréactivité bronchique (1) • Grande variabilité entre animaux d ’espèces différentes et entre animaux de même espèce Réactivité bronchique aux stimuli directs • Agonistes cholinergiques (acétylcholine, métacholine et carbachol), histamine, PGF2, LT, serotonine • comparaisons entre espèces difficiles • pour la métacholine : réponse maximale et sensibilité élevées pour cobaye > rat > lapin >chat > chien (sauf Basenji-greyhound=HRBNS naturelle) • déterminants in vivo : • force de contraction vs impédance du raccourcissement (Pel parenchyme, cartilage, rigidité par repliement de la muqueuse…) • quantité de muscle lisse (cobaye > rat ou lapin) • maturation (variation métabolisme des phosphoinositides) • génétiques (Basenji-greyhound, rat , souris, cobaye)

42. Modèles animaux d’hyperréactivité bronchique (2) Réactivité bronchique aux stimuli indirects (cellules effectrices autres que musculaire lisse) • Adénosine , neurokinine A (mastocytes) • Bradykinine (B1,B2 - eos/macrophages et fibres NANC) cf rats sensibilisés antagonistes des récepteurs B2 Hyperréactivité induite par mécanismes non allergéniques • Ozone (chien / rat Lewis Long Evans - serotonine IV  Wistar, Sprague-Dawley, Brown Norway, Fisher 344) • Séphadex (rat: augm réactivité bronchique à la sérotonine IV/ eosino) • Agonistes contractiles (LTD4, bradykinine, PAF-cobaye) • Cytokines: cobaye - IL5 (eos), IL8 (TxA2) • endotoxine: cobaye - HRB subst P

43. Modèles animaux d’hyperréactivité bronchique (3) Réponses des VA aux allergènes et hyperréactivité - modèles murins +++: OVA ip - 4 semaines - aerosol OVA histamine et serotonine ( homme) HRB variableA/J >>>C57BL/6J indépendant inflamm VA, eosino, IgE totales ou spécifiques HRB chez Balb/c sans eosino des VA - rat : OVA, TMA / HRB indépendant inflamm des VA et dissociation effet tt antiinflamm sur HRB et VA / NB:agonistes cholinergiques IV - cobaye :OVA, ac plicatique (cf cèdre rouge), toluène diisocyanate -

44. Modèle murin et génétique de l’hyperréactivité bronchique Intérêt du modèle murin • Génome murin: marqueurs satellites permettant l ’identification de loci (d’intérêt physiologique)  gènes candidats (clonage positionnel…) • Similarités génome humain et murin • Connaissance de la réponse immunitaire chez la souris • Souris KO ou surexprimant un gène cible

45. Cytokines et modèles murins d’asthme

46. Modèle murin d’asthme (BALB/c – OVA): hyperréactivité bronchique et cellules à mucus épithéliales (H Hirose et al, J Pharmacol Sci 2003,92:209 – 217)

47. Modèle de remodelage des voies aériennes in vivo chez le rat Palmans et al, Am J Resp Crit Care Med 2000; 161: 627-635

48. Effet de l’exposition allergénique répétée chez le rat Palmans et al, Am J Resp Crit Care Med 2000; 161: 627-635 concentration carbachol (mg/ml)

49. Cellules dendritiques, asthme et modèle murin GM-CSF

50. Augmentation du nombre de cellules dendritiques chez les souris BALB/c sensibilisées OVA stimulées par aérosol d’OVA vs PBS (B. N. Lambrecht, Allergy 2005: 60: 271–282)