Etude des interactions entre le chitosane et diverses souches bactériennes en milieux aqueux.

1. Etude des interactions entre le chitosane et diverses souches bactériennes en milieux aqueux. DEA « Chimie et Microbiologie de l ’Eau » Laurence Giraud Encadrant : Yves Andres Maître assistant, HDR

2. PLAN DE LA PRESENTATION • Introduction • Généralités sur la chitine et le chitosane • Généralités sur les bactéries • Cinétiques de mortalité • Matériels et Méthodes • Caractérisation des matériaux • Etude de la survie des bactéries dans divers milieux • Approche mécanistique • Résultats et Discussion • Spectres IR-TF et Titrages acido-basiques • Courbes de survie des bactéries dans divers milieux • Approche mecanistique • Conclusion et Perspectives

3. INTRODUCTION • Dispersion des micro-organismes résistants par les installations traitant l ’eau (Gerba et al., 2003) • Aeromonas Hydrophila (E.P.A.) • 103-104 UFC/mL dans eaux de surface • 102-103 UFC/mL dans les réseaux de distribution • Toxicité des produits de désinfection actuels (Chlore, dioxyde de chlore, ozone) • Exemple : le dioxyde de chlore est capable de se combiner à la matière organique du milieu et de former des composés aromatiques chlorés nocifs • Afin de pallier à ces problèmes techniques de mises en œuvre, utilisation du chitosane pour le traitement des eaux. • L ’E.P.A. a déjà approuvé l ’usage du chitosane dans l ’eau (jusqu ’à 10 mg/L) • But de l ’étude : Etudier les interactions et les effets entre le polymère et les souches bactériennes : deux Gram-négatives, Escherichia coli et Pseudomonas aeruginosa, et deux Gram-positives, Staphylococcus saprophyticus et Enterococcus faecalis

4. (a) Généralités sur la chitine et le chitosane INTRODUCTION CH 3 C O Structures moléculaires de la chitine (a) et du chitosane (b). CH OH 2 CH OH NH 2 O O HO O O O O HO O HO CH OH 2 NH NH C O C O CH CH 3 3 (b)

5. Nombres d’onde caractéristiques (cm-1) des principales vibrations amines et amides des polymères. DA = (Harish Prashanth et al., 2002) ; DA = (Khor, 2001) • % NH2 = (Broussignac, 1968 ; cité par Saucedo, 1993) Généralités sur la chitine et le chitosane INTRODUCTION Propriétés et caractérisation • Analyses physiques du chitosane • polymère très peu poreux • Analyse infra-rouge • Comportement acido-basique du chitosane

6. Comparaison des enveloppes des bactéries Gram-positives et Gram-négatives (Maier et al., 2000). Généralités sur les bactéries INTRODUCTION La paroi bactérienne

7. INTRODUCTION • ln = -Kt • N = nombre de micro-organismes présents au temps t, • N0 = nombre de micro-organimes présents au temps 0, • K = constante caractéristique du type de désinfectant, • des micro-organismes et de l’aspect de la qualité de l’eau du système (min-1), • t = temps (min). Cinétiques de mortalité Le modèle de Chik-Watson (Montgomery, 1985)

8. Caractérisation du matériel utilisé MATERIELS ET METHODES • Analyse infra-rouge • Caractérisation des matériaux par spectroscopie IR-TF (pastillage de l ’échantillon) • Titrages acido-basiques des polymères • Dissolution des polymères dans de l ’acide chlorhydrique 0.1M et dosage par la soude Etude de la survie des micro-organismes dans divers milieux • Dans l ’eau déminéralisée • Dans une suspension de chitosane déacétylé à 80 % • Influence du degré de déacétylation du chitosane • Influence de la concentration en chitosane déacétylé à 80 % Etude mécanistique • Intégrité des couches pariétales • Libération de protons • Libération d ’ions potassium • Force ionique

9. MATERIELS ET METHODES ensemencement réacteurs (2 duplicats par milieux) : eau déminéralisée, suspension de chitine, suspension de chitosane déacétylé à 60 % et suspension de chitosane déacétylé à 80 % Protocole de numération des colonies Etude de la survie des micro-organismes dans divers milieux

10. Spectres infra-rouge de la chitine et du chitosane (déacétylé à 80 %). Détermination du degré d’acétylation (+/- 5 %) à partir de l’analyse des spectres infra-rouge (les résultas représentent les valeurs moyennes des duplicats). Caractérisation des matériaux par spectroscopie IR-TF et titrimétrie des polymères RESULTATS ET DISCUSSIONS Analyses des spectres infra-rouge

11. Titrage acido-basique du chitosane (France Chitine). Comparaison des taux de fonctions aminées (%) du chitosane et de la chitine selon la méthode d’analyse utilisée. Caractérisation des matériaux par spectroscopie IR-TF et titrimétrie des polymères RESULTATS ET DISCUSSIONS Analyses des titrages acido-basiques Comparaison des taux de déacétylation des polymères selon la méthode d ’analyse

12. RESULTATS ET DISCUSSIONS Exemple de courbe de survie obtenue pour les quatre souches de bactéries : E. coli (), P. aeruginosa (), E. faecalis (), et S. saprophyticus (), dans l’eau déminéralisée en présence de chitosane (80 %). Eau déminéralisée additionnée de polymères Eau Déminéralisée Chitosane (80%) Chitosane (60%) Chitine -6,00E-04 -227,00E-04 E. coli -905,00E-04 6,00E-04 P. aeruginosa -12,00E-04 -132,00E-04 9,00E-04 E. faecalis. -25,00E-04 -367,00E-04 1,00E-04 S. saprophyticus (ds NaCl) -16,00E-04 -281,00E-04 -50,00E-04 3,00E-04 Constantes de mortalité (minute–1) des bactéries dans quatre milieux : eau déminéralisée, suspension contenant du chitosane déacétylé à 80 % et déacétylé à 60 % et suspension contenant de la chitine. Etude de la survie des MO dans divers milieux

13. RESULATS ET DISCUSSIONS Courbe représentant les constantes de mortalité de E. coli selon la concentration en chitosane déacétylé à 80 %. Etude de la survie des MO dans divers milieux Influence de la concentration en chitosane

14. RESULTATS ET DISCUSSIONS Concentrations en Carbone Organique Dissout dans trois milieux différents avec E. coli (mg.L-1). Courbes représentant les constantes de mortalité de Escherichia coli selon la quantité de K+ rejetés (a) et la quantité en ions potassium libérés dans le milieu pour différentes concentrations en polymère (b). Approche mécanistique Intégrité des couches pariétales Libération des ions potassium

15. Composition ionique de l’eau de source Sainte-Aude (mg.L-1). Eau de source additionnée de polymères Eau de Source Chitosane (80%) Chitosane (60%) Chitine -6,00E-04 -17,00E-04 -29,00E-04 -8,00E-04 E. coli Constantes de mortalité (minute–1) des bactéries dans quatre milieux : eau de source, suspension contenant du chitosane déacétylé à 80 % et déacétylé à 60 % et suspension contenant de la chitine. Approche mécanistique RESULTATS ET DISCUSIONS Influence de la présence d ’ions dans le milieu L ’eau de source permet de voir un effet possible de la présence d ’ions dans le milieu sur la mortalité de E. coli

16. CONCLUSION ET PERSPECTIVES • Action différente sur les quatre souches de bactéries, mais pas de comparaison notable entre mortalité des Gram-négatives et mortalité des Gram-positives • Effet antibactérien du chitosane • Rôle majeur des fonctions NH2 du chitosane dans la diminution de la population bactérienne • Interaction probable entre les fonctions amines libres du chitosane et des groupements fonctionnels des bactéries • Les cellules ne se lysent apparemment pas • Possibilité de réutiliser le polymère après réalisation d ’une première cinétique de mortalité • D ’autres études nécessaires à la caractérisation de la mortalité des cellules • Utilisation du polymère dans le traitement des eaux