Biología Molecular en asistencia e investigación

1. Biología Molecular en asistencia e investigación Conferència donada per Sílvia Pairet als alumnes de 2on de CFGS de Laboratori a l’IES Pedraforca (26-11-09) Hospital del Mar PRBB

2. Y después del CFGS, ¿Qué? Tenemos varias opciones: - Seguir estudiando una carrera: enfermería, fisioterapia, biología, biotecnología, medicina, farmacia... - Estudiar otro ciclo formativo: anatomía patológica - Ponernos manos a la obra :

3. Dónde podemos trabajar... • Laboratorios Privados Tarea asistencial • Centros Hospitalarios : Diagnóstico y seguimiento • Laboratorios de investigación : Investigación básica conocer los fundamentos Investigación traslacional  práctica clínica

4. El técnico de laboratorio 3 tipos de técnicos: 1) El técnico que se especializa 2) El técnico ayuda de manera general en el laboratorio 3) El técnico asociado a un proyecto

5. Esquema • Bases de la Biología Molecular • Biología del Cáncer • El laboratorio de Biología Molecular • Fundamentos de las técnicas

6. Bases de la biología molecular • Bases de la Biología Molecular • Biología del Cáncer • El laboratorio de Biología Molecular • Fundamentos de las técnicas

7. El genoma Los cromosomas están formados por ADN que contiene toda la información genética de una célula. Los genes determinan nuestro código genético.

8. El genotipo • Es el contenido genético de un individuo en forma de ADN • La secuencia de • nucleótidos constituye • la cadena de ADN y • el conjunto de genes • de un organismo

9. El fenotipo • Las características físicas de cada persona • vienen determinadas por nuestro código genético • El Fenotipo es la • expresión del • Genotipo • de cada persona • individualmente

10. Un repaso a la molécula de ADN Azúcar + Base Nitrogenada + Grupo fosfato

11. Codón

12. Proteína CODÓN AMINOÁCIDO

13. ¿Qué información nos están dando los genes? Al formar una frase lo que hacemos es enlazar un conjunto de palabras : Sehr angenehm. Es tut mir leid. Para poder descifrar la información que contiene necesitaremos traducirlo. En el código genético, este paso sería conocido como: Dogma Central de la Biología

14. Síntesis de proteínas Una enzima sintetiza un ARNm que mantiene la información de la secuencia de ADN para formar una proteína. Dicha proteína está expresando la información contenida en los genes de una célula determinada ADN ARN polimerasa

15. Expresión genética La insulina es el resultado de la información codificada que contenía el ADN. Sin la correcta intervención de todos estos componentes, no tendríamos la Insulina como expresión de la información genética.

16. Todas las células de un individuo tienen los mismos genes 99% homología Fenotípicamente, son muy diferentes…Porqué?

17. Expresión génica Es la combinación de qué genes están activos y cuáles inactivos lo que hace que cada célula sea diferente Expresión Genes inactivos

18. Biología del cancer • Bases de la Biología Molecular • Biología del Cáncer • El laboratorio de Biología Molecular • Fundamentos de las técnicas

19. Enfermedad genética producida por la mutación de determinados genes en una célula determinada. Cáncer: Un problema de frenos y acelerador 2 tipos de genes implicados en el cáncer... Oncogenes Genes supresores de tumores

20. Mutación Alteración de la secuencia del ADN original. Esto provoca cambios en la información genética del individuo.

21. Oncogenes • En condiciones normales hacen que la célula avance en su ciclo y se divida. • Si están hiperactivados debido a una mutación, la célula se reproduce sin control. Aceleradores • Cuando estos genes se expresan más de la cuenta, • pueden causar cáncer.

22. Genes supresores de tumores • Regulan el ciclo de división celular, arreglan anomalías ADN y si la célula tiene una lesión en el ADN apoptosis • Mutados, la célula es incapaz de suicidarse y continúa dividiéndose de manera defectuosa Frenos • Cuando estos genes no se expresan, pueden causar • cáncer

23. El laboratorio de biología molecular Perspectivas de futuro Bases de la Biología Molecular Biología del Cancer El laboratorio de Biología Molecular Fundamentos de las técnicas

24. Biología molecular: Estudio de los procesos que se desarrollan en los seres vivos desde un punto de vista molecular.

25. OBJETIVO DE LA BIOLOGÍA MOLECULAR(I) Conocer: Cómo se regulan los genes Cómo funcionan las proteínas resultantes Cómo se alteran en situaciones patológicas específicas Translocación

26. OBJETIVO DE LA BIOLOGÍA MOLECULAR (II) Para hacer: Un diagnóstico adecuado Acciones terapéuticas curativas (tratamientos dirigidos a la alteración molecular) Permitir el diseño de pautas preventivas (seguimiento del paciente)

27. Diagnóstico de la LMC (I) Esta enfermedad presenta una alteración molecular debido a la translocación de 2 cromosomas, que dan lugar al cromosoma Filadelfia.

28. Translocación Diagnóstico de la LMC (II) El gen ABL es un proto-oncogén que actúa de forma normal como un acelerador en la célula. La proteína BCR-ABL actúa como acelerador del ciclo celular haciendo que las células se dividan de forma descontrolada e inhibiendo la reparación por daño al ADN

29. Diagnóstico de la LMC (III) Si se detecta la presencia de esta alteración molecular podemos corroborar el diagnóstico con la ayuda de otros criterios Activación del gen Existen tratamientos con fármacos que van dirigidos a bloquear la proteína que se activa por la fusión de este gen BCR-ABL, y de esta manera evitar la proliferación descontrolada Fármaco que impide la activación del gen

30. Diagnóstico de la LMC (IV) La pauta preventiva se realizaría comprobando la cantidad de copias del gen durante el seguimiento del paciente para determinar si este gen sigue expresándose o no. Gráfica del seguimiento del paciente

31. Técnicas de biología molecular • Bases de la Biología Molecular • Biología del cáncer • El laboratorio de Biología Molecular • Fundamentos de las técnicas de Biología Molecular

32. Técnicas Moleculares para el Diagnóstico de la LMC 1. Extracción de ácidos nucleicos 2. Cuantificación 3. RT-PCR 4. PCR Convencional 5. Secuenciación Directa 6. PCR Cuantitativa

33. Recepción de muestras • Recepción de muestras : SP, MO, Tejido, Citologías • Extracción de ADN y/o ARN • Valoración de la calidad • Diferentes técnicas en función de los estudios relacionados con las diferentes neoplasias

34. Empieza el juego... Densidad pH

35. Separación de células 1. Separación de las células que nos interesan mediante centrifugación por Gradientes de densidad. Los componentes de la mezcla se reparten en diferentes fases en función de la densidad y de la afinidad por los componentes químicos que utilizamos

36. Obtención de los ácidos nucleicos 2. Desnaturalización de los ácidos nucleicos. Se provoca la ruptura de la pared celular para que el ADN quede libre en la mezcla 3. Purificación del resto de componentes mediante centrifugación

37. Precipitación de los ácidos nucleicos 3. Precipitación de los ácidos nucleicos para formar un pellet celular que resuspenderemos en un tampón adecuado y a una concentración óptima

38. RATIO: Abs 260/280 Restos de proteínas y alcoholes Concentración (ng) de ácidos nucleicos Valoración calidad/pureza El Espectrofotómetro mide la absorbancia de la luz a través de la muestra a una longitud de onda determinada

39. Técnicas Moleculares para el Diagnóstico de la LMC 1. Extracción de ácidos nucleicos 2. Cuantificación 3. RT-PCR 4. PCR Convencional 5. Secuenciación Directa 6. PCR Cuantitativa

40. Reacción en Cadena de la Polimerasa (PCR)

41. Es como hacer un caldo... = +

42. PCR (I) 1. DNA MOLDE. Segmento de ADN de doble cadena que contiene la secuencia diana que queremos amplificar 2. PRIMERS. Pequeños fragmentos de ADN de cadena simple. Complementarios a los extremos flanqueantes del ADN molde. Marcarán el punto de partida y delimitarán la zona de ADN a amplificar

43. PCR (II) A C G T 3. dNTPs. Suplemento de nucleótidos. Sustrato que usará la Polimerasa cuando produzca el nuevo ADN 4. DNA POLIMERASA. (Taq Polimerasa) Enzima que produce las copias de ADN 5. Tampón y MgCl2. Adición de sales y un tampón que mantenga el pH adecuado en la mezcla

44. Veamos que pasa dentro del caldo...

45. Ciclos de amplificación

46. Desnaturalización La muestra se lleva a una temperatura de 94-96°C para que se rompan los puentes de hidrógeno y las dos cadenas del ADN molde se separen

47. Hibridación Los primers o cebadores que hemos añadido en la muestra actúan a una temperatura de entre 50 y 70ºC para unirse uno por cada extremo a las cadenas de ADN molde de manera complementaria. De esta manera delimitarán la zona a amplificar

48. Extensión La ADN polimerasa actúa a 72ºC para que se realice la extensión de las cadenas de ADN por complementariedad de bases entre los dNTPs y la cadena molde

49. Y esto es lo que ocurre...

50. Original DNA target region Thermal cycle En 32 ciclos, al 100% de eficiencia, se crean más de mil millones de copias del ADN de interés!