Auditions de l’École Doctorale Sciences de la Vie et de la Santé

1. Auditions de l’École DoctoraleSciences de la Vie et de la Santé Christian MORABITO 11 et 12 Juillet 2012

2. PARCOURS UNIVERSITAIRE • 2007-2010 : Licence Sciences de la Vie Mention AB • 2010-2012 : Master Recherche Sciences de la Vie Mention Bien Spécialité Biologie des Interactions STAGES : Etudes des interactions plantes - agents pathogènes 2011 : Master 1 UMR IBSV 6 mois Identification du gène SG1 impliqué dans l’interaction Plante-Oomycète 2012 : Master 2 UMR ISA 6 mois Analyse de 4 gènes de parasitisme du nématode à galles COMPÉTENCES Biologie moléculaire et cellulaire, biologie végétale et interactions plantes-microorganismes

3. Caractérisation de fonctions d’Arabidopsisthalianaimpliquées dans la mise en place de la maladie lors de l’interaction racinaire avec Phytophthora parasitica Co-encadrement : Franck Panabières & Agnès Attard UMR Institut Sophia-Agrobiotech Équipe Interactions Plantes-Oomycètes Sophia-Antipolis

4. LES OOMYCÈTES • Microorganismes eucaryotes filamenteux • Pathogènes d’animaux et de plantes • Responsables de pertes agricoles importantes • Coût annuel : 10 milliards d’euros Fongicides inadaptés Identifier de nouveaux moyens de lutte COMPRENDRE LES INTERACTIONS PLANTES / OOMYCETES

5. ETUDE DES INTERACTIONS PLANTES / OOMYCETES • Identifier des fonctions végétales nécessaires au développement de la maladie Gène de sensibilité : fonction végétale détournée par l’oomycète pour conduire au succès de l’interaction • Modèle d’étude Phytophthora parasitica: Arabidopsis thaliana: Plante modèle Pathogène racinaire Large spectre d’hôte

6. L’interaction Arabidopsisthalianaet Phytophthora parasitica Nécrotrophie Sporulation INTERACTION A. thaliana / P. parasitica Adhésion Biotrophie Pénétration Germination

7. OBJECTIFS DE LA THÈSE Fonctions végétales nécessaires au développement de la maladie ? Génétique directe Phénotype  Gène Génétique inverse Gène  Phénotype Crible génétique Caractérisation du gène de sensibilité SG1 Gènes de sensibilité essentiels au développement de la maladie

8. 1 - IDENTIFICATION DE GÈNES ESSENTIELS À LA SENSIBILITÉ Approche sans à priori • CRIBLAGE EMS Ecotype SENSIBLE à P. parasitica Identification de mutants de sensibilité • VALIDATION DES MUTANTS : La perte de la fonction d'un facteur de sensibilité? • IDENTIFICATION ET CARACTERISATION DU GENE MUTÉ Caractérisation de fonctions végétales essentielles a la sensibilité racinaire

9. WT 2 - ÉTUDE DU ROLE DE SG1 DANS LA SENSIBILITÉ d’A. thaliana sg1 SG1 est un gène de sensibilité à P. parasitica SG1 est fortement induit au cours de la pénétration 2,5 h 30 h Biotrophie Nécrotrophie Pénétration SG1 est un gène de sensibilité Jours

10. 2 - ÉTUDE DU ROLE DE SG1 DANS LA SENSIBILITÉ d’A. thaliana SG1 est un gène de sensibilité à P. parasitica LA PROTÉINE SG1 APPARTIENT À UNE FAMILLE DE 64 MEMBRES : 1 586 Cysteine/Histidine-rich C1 domainfamily : Domaines riches en Cystéine/Histidine Domaine de liaison au Diacylglycérol Diacylglycérol : Phospholipide messager Signalisation intracellulaire • Fonction biologique de SG1 dans le développement de la plante ? • Comment SG1 favorise le développement de la maladie ?

11. PSG1 PSG1 SG1 GFP GFP T T 2 - ÉTUDE DU ROLE DE SG1 DANS LA SENSIBILITÉ d’A. thaliana • Fonction biologique de SG1 dans la plante ? • LOCALISATION DE L’EXPRESSION DU GÈNE • RÔLE DE LA PROTÉINE DANS LE DÉVELOPPEMENT DE LA PLANTE • Analyse du phénotype du mutant sg1 (anatomie, niveau tissulaire et cellulaire) Localisation spatio-temporelle de la transcription Localisation spatio-temporelle de la protéine Fonction biologique de SG1 au cours du développement

12. PSG1 GFP T 2 - ÉTUDE DU ROLE DE SG1 DANS LA SENSIBILITÉ d’A. thaliana • Fonction biologique de SG1 pendant l’infection ? • Quel stade de la maladie est affecté chez le mutant sg1? Nécrotrophie Biotrophie Pénétration • Analyse cytologique du mutant • Mesure de la biomasse du pathogène • Expression de gènes marqueurs de ces différents stades ? ? ? • Localisation de l’expression du gène pendant l’interaction Localisation spatio-temporelle de la transcription Où et quand la fonction biologique de SG1 est manipulée pour favoriser le développement de P. parasitica

13. 2 - ÉTUDE DU ROLE DE SG1 DANS LA SENSIBILITÉ d’A. thaliana • Fonction biologique de SG1 pendant l’infection ? • Effet de la mutation sur les voies de défenses • Dosage des phytohormones de défenses • Analyse des voies de défenses à l’aide de gènes marqueurs (q-RT-PCR) • SG1 est-elle impliquée dans la sensibilité à d’autres agents pathogènes racinaires ? Spécifique de P. parasitica?

14. 2 - ÉTUDE DU ROLE DE SG1 DANS LA SENSIBILITÉ d’A. thaliana • Fonction moléculaire de SG1 ? Signalisation Réponses aux stress biotiques et développement Phospholipase C Diacylglycérol Kinase DAG PA PIP2 ? SG1 • La protéine se lie t’elle au DAG ? • - Purification de la protéine et test de liaison au Diacylglycérol • SG1 perturbe la signalisation via le diacylglycérol ? • - Inhibition de la Phospholipase C : Phénotype mutant mimé ? • - Dosage du PA au cours de l’interaction Implication du DAG dans la sensibilité à P. parasitica

15. CONCLUSIONS ET PERSPECTIVES • RÉSULTATS ATTENDUS • Identification de gènes de sensibilité • Premier gène de sensibilité à P. parasitica • Premières données sur la fonction d’une famille de gènes Proposer des pistes pour la sélection de plantes résistantesà P. parasitica • ATOUTS DU PROJET • PathosystèmeArabidopsisthaliana / Phytophthora parasitica • Interactions racinaires peu étudiées • L’ensemble des outils et lignées déjà disponibles : premiers résultats rapidement publiables

16. Auditions de l’École DoctoraleSciences de la Vie et de la Santé Merci de votre attention

17. Rôle de SG1 dans l’interaction • La mutation sg1 limite-t-elle la pénétration de l’oomycète dans les tissus ? • Comptage du pourcentage de zoospores ayant pénétré dans les racines pour le sauvage et le mutant sg1 • La mutation sg1 favorise-t-elle le prolongement de la phase biotrophe au détriment de la nécrotrophie ? • Analyse de la durée de la phase biotrophe sur une cinétique de plusieurs jours

18. Contribution de SG1 à la sensibilité ?Le gène SG1 : 1 1791 5’ UTR 3’ UTR C1-Like DC1 DC1 Domaine de liaison au Diacylglycérol ou intermédiaire ? Domaines riches en C/H • Gène de fonction inconnue • 1791 nucléotides, sans intron (596 acides aminés) • « Cysteine/Histidine-rich C1 domainfamilyprotein » : Famille de fonction inconnue de 64 protéines chez Arabidopsisthaliana Propriétés biochimiques de la protéine ? Analyse de voies métaboliques liées au DAG (inhibiteurs, mutants) Production de la protéine (liaison au DAG ?) Identification d’interactants (co-immunoprécipitation)

19. L’interaction Arabidopsis thaliana et Phytophthora parasitica Nécrotrophie Sporulation INTERACTION Arabidopsis / P. parasitica Adhésion Biotrophie Encystement pénétration Germination Haustorium Appressorium

20. Pour moi ca reste trop sec comme transitionL’autre cycle est plus joli non? Titre pas assez separé L’interaction Arabidopsis thaliana et Phytophthora parasitica Pénétration Biotrophie 2 HAI Germination 10 HAI Adhésion Nécrotrophie 14 DAI 3-4 JAI Sporulation et Dissémination

21. OBJECTIFS DE LA THÈSE • 1 - Etude du rôle du gène de sensibilité SG1(Susceptibility Gene 1) dans la sensibilité d’A. thaliana. 2 - Caractériser de nouveaux gènes de sensibilité essentiels à l’infection d’A. thalianapar P. parasitica