Állatkísérletek az orvostudományban- In vitro modellek élő állatok helyettesítésére

1. Állatkísérletek az orvostudományban- In vitro modellek élő állatok helyettesítésére Tuboly Eszter Tanársegéd Sebészeti Műtéttani Intézet

2. Az alternatívák szükségessége • Élő modellek kiváltása • Társadalmi megítélés, az igény egyre nő • Szervezeti fellépések • Törvényi szabályozás • Költségek, ellenőrzés • 2013. 03.11-étől Európai Unió megtiltotta a kozmetikai ipar számára folytatott állatkísérletek végzését • SEURAT-1 (50 millió €)

3. In vitro modellek előnyei • Csak a vizsgált mechanizmusra fókuszálnak • Egyszerűbb kezelni, kisebb a kockázat, felelősség • Sokszor szükségesek a publikáláshoz • Időmegtakarítás, elemszám • Hátrányok • Nem feltétlenül költséghatékonyabb • Nem igazán életszerű • Sejttenyészet: fertőződés (mycoplasma) • Krónikus, szisztémás reakciók vizsgálatára nem alkalmas

4. A 3 R: • Replacement • Reduction • Refinement Russell and Burch

5. A helyettesítés egyre hatékonyabb

6. Csak kémiai komponensek Szöveti homogenizátum, izolált organellum Ex vivo kísérletek Sejt-és szövetkultúrák Mesterségesen növesztett szövetek, szervek Invazív beavatkozás helyett kezelés Lehetőségek élő állatmodellek helyettesítésére

7. Biokémiai tesztek • Immunkémiai technikák (bakteriális toxinok azonosítására) • Szerv, szövet vagy sejtkultúrák (biokémiai kutatások céljára) • Mikroorganizmusok (karcinogén ill. mutagén anyagok tesztelésére) • Magasabbrendű növények • Néhány metazoa parazita • Komputer szimulációs modellek

8. 1907 óta létező technika ’50-es évektől kezdve elterjedt eljárás Áttörések: antibiotikumok, médium, tripszin Társaságok, sejt-és szövetbankok Izolált-és mai napig fenntartott sejtvonalak (HeLa) Tenyésztő eszközök rohamos fejlődése (gyógyszergyártás) Gén-és biotechnológia alappillére (klónozás) Rákkutatás (nanotechnológia) Őssejt-és génterápia (etikai kérdések) Szintetikus biológia (mesterséges szervek, programozott sejtek) Virológia (vakcinák készítése) Sejttenyésztés

9. Vizsgálati lehetőségek • Az adott sejt életfolyamatainak nyomonkövetése(sejtanalízis) • sejt-sejt kölcsönhatások, a sejtkommunikáció vizsgálata (neuronok) • a sejtek különböző kémiai anyagokra adott válaszának analízise (gyógyszerfejlesztés) • különböző sejteredetű fehérje termékek előállítására (biotechnológiai ipar) • “tissue engineering” céljára • Sejttenyészetek eredete: • szöveti explantok ("explant kultúrák") • sejtszuszpenzió ("szuszpenziós kultúrák")

10. Primer tenyészetek: embrionális ill. felnőtt szövetből korlátozott ideig tarthatók fenn élettartamuk véges (hetek, néhány hónap) előnyük: a sejtek nem tekinthetők módosított ill transzformált sejteknek, mivel a tenyésztés kezdő lépéseként alkalmazott enzimatikus, vagy mechanikus disszociáción kívül a sejteket más hatás nem éri. hátrányuk: a kultúrák korlátozott élettartama minden egyes preparátum kicsit eltér egymástól, teljesen homogén idegen sejtet nem tartalmazó tiszta tenyészetről nem beszélhetünk. Sejtvonalak: abnormális, gyakran transzformált sejtek homogén sejtpopuláció élettartamuk korlátlan Leggyakrabban rákkutatási célok Könnyebb velük dolgozni, már nem kell izolálni Sejttenyészetek típusai

11. Ami nélkül nem megy… • Laminaris fülke • HEPA filter - steril levegő-áramot biztosít • Horizontális • Alevegő horizontálisan, a tenyésztő irányába áramlik • veszélyes anyagokkal való munkára nem alkalmas • Vertikális • A levegő felülről lefelé áramlik • veszélyes anyagokkal való munkára ez a típus a legalkalmasabb • CO2 Inkubátorok (5-10 %, 100%-os páratartalom) • Fáziskontraszttal ellátott invert mikroszkóp

13. Speciális tápfolyadék (médium) Ionikus homeosztázis Vitaminok, kofaktorok, fémek Fehérjék, lipidek Energia Szérum Bakteriocid-fungicid koktél Ablaktalan, fertőtlenített helység (meszelés) Steril öltözet UV-védelem Speciális tenyésztőedények Saját eszközök Vízfürdő, hűtőszekrény 70%-os alkohol Dezinficiens

16. A tenyésztőedények felületének kezelésére használjuk: • Kollagen (kötőszöveti fehérje) • Fibronectinek (sejtfelszíni és plazma fehérjék) • Laminin (heteromer glycoprotein) • Poly L-lysine (erősen pozitív töltésű polikationos polimer) • Poly-L-Ornithin (polikationos poliaminosav) • A tenyésztést segítő, a sejttenyésztő oldatokhoz adott szuplementumok: • Foetal bovine vagy calf serum • Növekedési faktorok • Insulin

17. Alkalmas sejttípusok • Általában bármilyen sejt, a legmacerásabbak az izom-és idegsejtek • Vérsejtek: a keringési rsz.-be kerülve már nem osztódnak, rövid élettartam • Fibroblaszt (kötőszövet): jól szaporodnak, generációs idejük rövid,gyorsan nőnek • Epithel (hám): egyszerű dolgozni velük, gyorsan nőnek • Embrionális sejtek: jól szaporodnak, kényesebbek • Sejtvonalak: már régóta fenntartott sejtek, rengeteg információ, már izolált sejtek (HeLa, HEK, CHO)

19. Sejtkultúra előállítása • Izolálás: szerv kiválasztása sejtciklus, sejtorganellum, sejtkapcsolatok, mozgás alapján, esetleg anyagi és metodikai korlát miatt • Konkrét állatmodell mellé in vitro bizonyítékok • neonatalis v. adult sejtek,embrionális sejtek, esetleg hibridómák, transzformált sejtek • Kezdeti sejtszám, életképesség ideje, növekedés üteme különböző • A felnőtt sejtek csak adherens módon képesek növekedni: laminin, vagy kollagén plate, coated-plate (akár recept alapján)

20. Szövetek szétválasztása sejtekké: emésztőenzimekkel vagy mechanikusan (hőfok, időtartam!), nyírőerő minimalizálása (potter) • Mosás, szűrés • Sejtek médiumba ágyazása, kezelése • Sejtnövesztés inkubátorban • Sejtszámolás időről-időre (ePetri) • Minden típus esetén szükséges a rendszer ki-titrálása • Kevert kultúrák esetén figyelem a fibroblasztokra • Passzálás • Viabilitási-tesztek • Proteomika, fagyasztás-felengedés (DMSO!)

22. A sejttenyésztő rémálma… Befertőződés • Kémiai anyagok által (lejárt médium) • Biológiai ágensek: baktériumok, gomba (mycoplasma-tesztek, alkohol, szájmaszk) • Médiumban indikátor: fenolvörös: metabolikus aktivitást jelez a pH változása • Fertőzésgyanúnál ki kell dobni a rendszert és mikrobiológiai vizsgálatot kérni • Újra kell fertőtleníteni a helyiséget és az eszközöket • Autokláv, inkubátor vízcseréje, alkohol • Félévente speciális takarítás ajánlott

24. Szövettenyésztés • Sejtek szövetekként történő növesztése egy speciális vázon (scaffold) • Célja: pótolni a többé már nem funkcióképes szöveteket, javítani az adott szerv funkcióját • Regeneratív medicína-szintetikus biológia-őssejt terápia • Fontos az immunrendszer válaszának minimalizálása (graft vs. host) így a legjobbak az autológ sejtek • Alkalmaznak allogén sejteket is (immunszupresszió, MHC mutációk) • Xenogén sejtek (sertés, anti-inflammációs gének KI- a jövő útja?)

25. Scaffold • Hálózatos polymer, különböző anyagokból készülhet (protein, poliszacharid, polipeptid) • Lehetővé teszi a sejtek számára a növekedést, átjárható a tápanyagok számára, ECM képes rajta létrejönni • Meg kell tartania a szövet eredeti 3D-s struktúráját • Biztosítania kell a sejtek számára megfelelő mikrokörnyezetet • Megengedi a sejtek migrációját

26. Egy ideális scaffold… • 3D • Keresztkötéseket tartalmaz • Pórusokat tartalmaz • Biológiailag lebontható • Megfelelő kémiai körülmények uralkodnak a felszínén • Bírja a mechanikai terhelést • Biokompatibilis • Elősegíti a természetes gyógyulási folyamatokat • Hozzáférhető • Nagyüzemben gyártható

29. Leggyakoribb típusok • Polymerek • Kollagén • Laminin • Fibrin • Decellularized matrix (szív) • Kristályos anyagok • Hydroxyapatite • Kálcium-foszfát • Bioglass

30. Elkopott porcok helyettesítése • Porcsejtek • Kollagén váz • Nem igényel kiterjedt érhálózatot

31. Csontnövesztés • Őssejtek csontsejtekké történő differenciálódásával • A parancs növekedési faktor függő • Nem szabad túl nagynak lennie a váznak, különben a sejtek nem kapnak elég oxigént 3D Calcium- scaffold

32. Kollagén-kitozán, vagy hialuronsav scaffold Egyszerre egyféle sejt, 3 sejtréteg Égési sérülteknél siker Bőrnövesztés

33. Cukorbetegek ß-sejtjeinek pótlása In vivo Islet of Langerhans in pancreas

34. Mesterséges véredények • By-pass műtéteknél használatos http://popularmechanics.com/popmech/sci/tech/9805TUMDOM.html

35. Szívizomsejt, véredények Felnőtt szívizomsejtek tenyésztése nehézkes Természetes scaffold (decellularized matrix) Sokféle sejttípus, bonyolult terület Szív regenerációja

36. Lehetőségek májbetegeknek

37. Bioprinting • Feltaláló: Forgách Gábor (Missouri Egyetem) • Hidro-gél alapú vázra élő sejtek felvitele • Tintasugaras nyomtatófej juttatja rá a sejteket, több rétegben, körben is (3D) • 2 nyomtatófejet használ: sejtek nyomtatása+gélszerű, tápanyagokban gazdag médium adagolása • Kalibráció: lézerrel történik, szoftver irányít • Véredények by-pass műtétekhez • Távolabbi célok : teljes szervek nyomtatása, bőrpótlás, mint rutin kezelés

39. Köszönöm a figyelmet!!!