Katarzyna Szołtysek Centrum Badań Translacyjnych i Biologii Molekularnej Nowotworów

1. POWIĄZANIA SZLAKÓW SYGNAŁOWYCH ZALEŻNYCH OD CZYNNIKÓW TRANSKRYPCYJNYCH NFkB I p53 W KOMÓRKACH NOWOTWOROWYCH PODDANYCH DZIAŁANIU CZYNNIKÓW GENOTOKSYCZNYCH – wpływ promieniowania na przebieg szlaku NFkB Katarzyna Szołtysek Centrum Badań Translacyjnych i Biologii Molekularnej Nowotworów

2. Mechanizm regulacji NFkB, współzależności z p53

3. Cel pracy • Identyfikacja funkcjonalnych współzależności między szlakami sygnałowymi zależnymi od czynników transkrypcyjnych NFkB i p53, poprzez m.in. scharakteryzowanie wpływu każdego z tych białek na ekspresję genów regulowanych przez drugi czynnik Cel szczegółowy: wpływ promieniowania na przebieg ścieżki NFkB • Analiza kinetyki aktywacji i przebiegu ścieżki sygnałowej zależnej od NFkBw komórkach stymulowanych promieniowaniem i /lub cytokiną TNFa(analiza Western-blot i EMSA) • Analiza wpływu promieniowania i aktywacji ścieżki zależnej od p53 na ekspresję wybranych genów regulowanych przez czynnik transkrypcyjny NFkB(analiza QRT-PCR) • Analiza wpływu czasu napromieniowania na ekspresję wybranych genów regulowanych przez czynnik transkrypcyjny NFkB(analiza QRT-PCR)

4. Model doświadczalny HCT116 (human colon carcinoma) • p53+/+ (wt) • p53-/- (knock-out) RYC.1. Komórki linii HCT116 (wt). Charakterystyka modelu doświadczalnego: • Indukcja ścieżki NFkB - degradacja inhibitora IkBa • Indukcja/akumulacja białka p53 RYC.4. Kinetyka degradacji białkaIkBa(Western-blot) w komórkach linii HCT116 stymulowanych cytokiną TNFa (15-min). RYC.2. Transkrypcja genu TP53 (RT-PCR) w komórkach linii HCT116 pod wpływem napromienienia UV-C. TNFa = 10ng/ml UV = 20J/m2 IR = 4 Gy RYC.3. Akumulacja białka p53 (Western-blot) w komórkach linii HCT116 pod wpływem napromienienia UV-C lub IR.

5. Analiza wpływu promieniowania i aktywacji ścieżki zależnej od p53 na aktywację szlaku NFkB i ekspresję wybranych genów zależnych od NFkB Układ doświadczalny: TNFa = 10ng/ml UV = 20J/m2 IR = 4Gy K lub Wykonane analizy: • identyfikacja genów indukowanych przez TNFa(profil ekspresji – macierz QRT-PCR) • ilościowa analiza zmian poziomu wybranych genów (QRT-PCR) • analiza kinetyki degradacji inhibitora IkBa(Western-blot) • analiza obecności aktywnego NFkB w jądrze komórkowym (EMSA) • Wybrane geny: • Podjednostki czynnika NFkB: geny NFKB1 i REL • Białka regulujące ścieżkę NFkB: geny NFKBIA, BCL3, TNFAIP3 • Geny odpowiedzi komórkowej prozapalnej (TNFA, IL1A, IL8, LTA ) i proprzeżyciowej (JUN)

6. Pre-ekpozycja komórek na promieniowanie hamujeaktywację NFkB i obniża poziom ekspresjigenów zależnych od NFkB w komórkach stymulowanychprzez TNFa; efektniezależny od statusu białka p53 RYC.1. Kinetyka zmian poziomu białka IkBa(Western-blot) w komórkach poddanych kombinacji stymulacji cytokiną TNF a i promieniowania UV. Przykładowa analiza przeprowadzona 1h i 6h po stymulacji cytokiną TNFa RYC.2. Detekcja aktywnych form NFkB(test EMSA)w ekstraktach jądrowych z komórek napromieniowanych UV i stymulowanych cytokiną TNFa (wynik testu przeprowadzonego przez dr Natalię Kashchak).

7. Analiza wpływu czasu napromieniowania i aktywacji ścieżki zależnej od p53 na ekspresję wybranych genów zależnych od NFkB Układ doświadczalny: TNFa = 10ng/ml UV = 20J/m2 Wykonane analizy: • ilościowa analiza zmian poziomu wybranych genów zależnych od NFkB(QRT-PCR)

8. Pre-ekpozycja komórek na promieniowanie obniża poziom ekspresjigenów zależnych od NFkB, indukowanych TNFa w sposób zależny od punktu czasowego ekspozycji; efektniezależny od statusu białka p53 p<0,01 (dla wersji eksperymentalnych UV/TNF) RYC.3. Poziom ekspresji genu IL8(QRT-PCR)w punkcie czasowym 1h po stymulacji cytokiną TNFa w komórkach linii HCT116. Przedstawiono wartości średnie z 3 powtórzeń technicznych (wynik analiz odniesiono do poziomu ekspresji genu referencyjnego 18S rRNA analizowaniego w tych samych warunkach eksperymentalnych).

9. Pre-ekpozycja komórek na promieniowanie obniża poziom ekspresjigenów zależnych od NFkB, indukowanych TNFa w sposób zależny od punktu czasowego ekspozycji; efektniezależny od statusu białka p53 p<0,01 (dla wersji eksperymentalnych UV/TNF) RYC.4. Poziom ekspresji genu TNFAIP3(QRT-PCR)w punkcie czasowym 1h po stymulacji cytokiną TNFa w komórkach linii HCT116. Przedstawiono wartości średnie z 3 powtórzeń technicznych (wynik analiz odniesiono do poziomu ekspresji genu referencyjnego 18S rRNA analizowaniego w tych samych warunkach eksperymentalnych).

10. Pre-ekpozycja komórek na promieniowanie prowadzi do oscylacji poziomu ekspresjigenów zależnych od NFkB, indukowanych TNFa; efektzależny od statusu białka p53 p<0,01 (dla wersji eksperymentalnych UV/TNF) RYC.3. Poziom ekspresji genu IL8(QRT-PCR)w punkcie czasowym 1h po stymulacji cytokiną TNFa w komórkach linii HCT116. Przedstawiono wartości średnie z 3 powtórzeń technicznych (wynik analiz odniesiono do poziomu ekspresji genu referencyjnego 18S rRNA analizowaniego w tych samych warunkach eksperymentalnych).

11. Pre-ekpozycja komórek na promieniowanie prowadzi do oscylacji poziomu ekspresjigenów zależnych od NFkB, indukowanych TNFa; efektzależny od statusu białka p53 p<0,01 (dla wersji eksperymentalnych UV/TNF) RYC.4. Poziom ekspresji genu TNFAIP3(QRT-PCR)w punkcie czasowym 1h po stymulacji cytokiną TNFa w komórkach linii HCT116. Przedstawiono wartości średnie z 3 powtórzeń technicznych (wynik analiz odniesiono do poziomu ekspresji genu referencyjnego 18S rRNA analizowaniego w tych samych warunkach eksperymentalnych).

12. Podsumowanie • Komórkowa odpowiedź na promieniowanie jest modulowana przez sekwencję czasową aktywacji ścieżek sygnałowych zależnych od czynników NFkBi p53 • Napromienienie komórek poprzedzające stymulacjęcytokiną TNFa • hamowanie aktywacji ścieżki NFkBi osłabienie ekspresji genów zależnych od NFkB – niezależnie od p53 • oscylacje poziomu genów zależnych od NFkB – zależnie od p53