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Semen Analysis

Semen Analysis. 高雄醫學大學附設中和紀念醫院 檢驗醫學部 江建華. Hardware: PC Phase contrast microscope   Videodigitizer CCD camera Software : Windows NT 4.0 Microsoft Office 2000 CASA software . The computer age (I). Image analysis Amplitude of head displacement Velocity.

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Semen Analysis

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Presentation Transcript

  1. Semen Analysis 高雄醫學大學附設中和紀念醫院檢驗醫學部 江建華

  2. Hardware: PC Phase contrast microscope   VideodigitizerCCD camera Software: Windows NT 4.0 Microsoft Office 2000CASA software The computer age (I)

  3. Image analysis Amplitude of head displacement Velocity The computer age (II)

  4. Inaccurate at low & high concentration Cellular debris Cost QC The computer age (III)

  5. Normal values of semen variables (WHO 1992)

  6. Sample collection and delivery • Masturbation, condom, coitus interrupts. • 48 hours and no longer than 7 days of sexual abstinence. • Collect the whole volume. • Deliver specimen to the laboratory in 30 min. • Avoid extreme temperature while transport the sample.

  7. Macroscopic evaluation • Appearance • Volume • pH • Viscosity (consistency) * The thread should not exceed 2 cm.

  8. Microscopic investigation (I) • Motility: makler counting chamber nine or sixteen squares • Estimation of sperm concentration makler counting chamber 50℃~60℃ water bath • Sperm viability: eosin y stain

  9. Microscopic investigation (II) • Morphological characteristics Papanicolaou stain, HE or Liu’s stain • Cells other than spermatozoa polygonal cells spermatogenic cell WBC

  10. MAKLER counting chamber (I)

  11. MAKLER counting chamber (II)

  12. MAKLER counting chamber (III) • Advantages • Dilution is unnecessary, accuracy of analysis is enhanced through the elimination of various steps required by the usual hemocytometric technique. • The specimen can be analyzed quickly. • The chamber is quickly and easily available for reuse.

  13. A Look at Sperm Morphology.

  14. Evaluating Sperm Morphology by Kruger’s Strict Criteria.

  15. Sperm function test • The hamster egg penetration assay • The in-vitro acrosome reaction • The cervical mucus penetration test • The hypoosmotic swelling test • Antisperm antibody

  16. 臨床意義（Clinical significance） • 男性不孕症（infertility）的評估。 • 輸精管切除手術的評估。 • 法醫學（medico legal）的目的。

  17. 採檢須知

  18. 精液之檢測時間 • pH值必須馬上檢測。 • 凝固及液化檢查：30分鐘內必須檢測。 • 運動率：收集時間後1小時及2小時各檢查一次。

  19. 退件原則 • 檢體標示與申請單不符。 • 檢體未依標準容器採檢。 • 檢體滲漏、污染申請單。

  20. 品質管制程序 • 精蟲數檢查： • 自製品管品： • 取一臨床正常檢體，精蟲數約20~30 x 106/ mL檢體，以10%中性福馬林固定，作為陽性品管。 • 固定後測定精蟲數由醫檢師以Makler counting chamber 計數20次求平均值（Mean）作為Target value。並計算SD值。 • 另取Normal saline作為陰性品管，其值為零。

  21. pH值試紙: • 執行品管時機： • 每次執行測試時。 • 至少每月一次。 • 以pH meter校正標準品（SUNTEX Instrument）之高值及低值液進行品管操作。 • 同一片試紙一半進行品管，另一半進行檢體測試。

  22. 作業步驟（Procedural steps） • 當檢驗室人員收到精液檢體時，需詢問病患收集時間，記錄在檢驗單，詢問病患是否符合採檢說明書之各項收集要點並注意是否溫度異常。

  23. 外觀及顏色： • 用肉眼觀察精液的外觀及顏色，並記錄在檢驗單。 • 凝固及液化： • 操作方法： • 每隔5'～10'看Semen是否液化，用竹棒挑起Semen看是否有粘 液，若粘液絲超過2公分表示未完全液化，不超過2公分表示液化，然後將液化的時間寫下。

  24. 量： • 操作方法： • 用一支5 mL空針，拔掉針頭，吸取Semen測其量。 • pH值： • 操作方法：以pH試紙沾精液後判讀。 • 試紙的使用： • 從冊子撕下一張試紙。 • 將試紙快速沾溶液並迅速移除。注意：試紙不可浸泡太久。 • 輕甩試紙移除過多的溶液。 • 在明亮區域立即和標準顏色比對（color standard）。

  25. pH 試紙使用注意事項： • 顏色深的溶液其buffer capacity很大。 （用水稀釋溶液去減少試紙受顏色的影響）。 • 混濁溶液或溶液有沉澱將試紙一面弄濕，用另一面去判讀。 • 黏稠檢體把試紙直接接觸溶液表面。 • Buffer capacity很小的溶液。 • 試紙不應該單獨用在Buffer capacity很小的溶液例如: 蒸餾水、自來水、海水、河水或含<0.01%的HCl或NaOH水 溶液，為了要得到正確的pH值必須用玻璃電極測量，得到的pH值和pH試紙比較可求得校正因子，當用試紙測pH值可代入校正因子即可。 • 若工作區域有酸或鹼的蒸氣將無法得到正確的結果。 • 若溶液中含有氧化劑或還原劑會將試紙脫色導致不正確的結果。 • 測量pH試紙時必須在室溫。溫度增加，試紙的顏色反應成分會消失導致錯誤結果 • 若試紙不常使用顏色會輕微變色，這不影響後續測試的準確性品質。

  26. 精蟲運動性： • 操作方法 : • 採用Makler counting chamber，以竹棒將Semen拌勻，沾一滴Semen於chamber中心點上，蓋上Cover glass, 避免產生氣泡，以200倍鏡檢隨機看一正方形區域 （9或16小格），計算運動率，操作兩次取平均值。 • 計算運動率：

  27. Forward Progression ： • 係檢查精子“向前衝”的活動力。 • 依序為ABCD級：將活動精蟲依下列等級區分，以%表示。 • A級：表示精子可快速且直線地向前衝。 • B級：表示精子慢速直線地或曲線狀地向前行。 • C級：表示精子原地運動但不前進。 • D級：表示精子無活動性。

  28. 精蟲形態： • 操作方法： • 將Semen 以wedge-pull film technique推片，smear 之working area必須精蟲分佈均勻，無overlapping。以Wright-Giemsa stain染色。 • 油鏡觀察，至少計算200隻精蟲。若精蟲數稀少需整片閱畢。

  29. 判讀：依1992 WHO 3rd Edition Methods criteria。 • 正常精蟲形態： • 頭部從正面看為卵圓形（oval form），側面看為西洋梨形，具正常平滑輪廓，頂體可明顯區分出來佔頭部區域40 ~ 70 %；液泡佔頭部區域小於20 %。 • 頭部：長度4 ~ 5.5 µm寬度2.5 ~ 3.5 µm長/寬比為1.5 ~ 1.75。 • 不可有細胞質小滴大於正常精蟲頭部的1/3 。 • 中節部分沒有異常。 • 尾部連接插入頭部不可大於頭部縱軸的90 %。 • 尾部無任何缺陷。

  30. 異常精蟲形態： • 利用上述分類大綱，不符合之精蟲皆視為不正常。 • 頭部缺陷：雙頭形、巨大形、矮小形、邊緣不整、空泡形、縮頭形、缺頭形、雙叉頭、不成熟。 • 頸部缺陷：彎曲或太細。 • 尾部缺陷：太短、太寬、尾部彎曲、尾部彎曲或尾端有小滴。 • 若正常型態之精蟲<30%，需由實驗室主管進行確認。

  31. 精蟲數： • 操作方法： • Markler counting chamber，以竹棒將精液混合均勻後，沾一滴Semen於chamber中心點上，蓋上cover glass, 避免產生氣泡，以200倍鏡檢，計算chamber內連續性10小格，所得之精蟲數乘以106即為每mL精蟲數。 • 隨機選取另10小格操作，兩次取平均值。

  32. Pellet Examination： • 以Makler counting chamber 計數精蟲數，若沒有發現精蟲則進行此檢查，特別是輸精管結紮（Vasectomy）術後評估。 • 將精液以Normal Saline 1：1 混合，裝於15 mL 離心管以1500 rpm離心10分鐘。 • 取底部沉澱物進行鏡檢。 • 若觀察到精蟲則報告Pellet Examination：" sperm present "。

  33. 計數WBC： • 操作方法： • 精液滴於玻片上蓋上蓋玻片，以光學顯微鏡400倍觀察計算WBC 數目。 • 注意事項：round cell有兩種，一是不成熟的精細胞（immature germ cell），具高濃染的單核或雙核伴隨大區域的細胞質，另一為多核性白血球（polymorphonuclear leukocyte）比germ cell小，N/C ratio也更小。

  34. 計數RBC： • 操作方法： • 精液滴於玻片上蓋上蓋玻片，以光學顯微鏡400倍觀察計算RBC 數目。 • 計數上皮細胞： • 操作方法： • 精液滴於玻片上蓋上蓋玻片，以光學顯微鏡400倍觀察計算上皮細胞數目。

  35. Spermatozoon with normal, oval-shaped head.

  36. Immature spermatozoon with tail coiled around its head.

  37. Spermatozoon with large head.

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