670 likes | 1.01k Views
TRANSKRYPCJA U EUKARYOTA. U Eukaryota występują trzy polimerazy RNA: I, II, III. Eukariotyczny promotor. Liczby oznaczają % sekwencji, w których dany nukleotyd występuje w danej pozycji. wg innych: T A T A W A A R (W = A lub T; R – puryna).
E N D
TRANSKRYPCJA U EUKARYOTA U Eukaryota występują trzy polimerazy RNA: I, II, III
Eukariotyczny promotor Liczby oznaczają % sekwencji, w których dany nukleotyd występuje w danej pozycji wg innych: T A T A W A A R (W = A lub T; R – puryna)
Ponieważ, pomiędzy sekwencją TATA a miejscem startu jest bardzo różna odległość (-25 do -100 pz) można przypuszczać, że samo miejsce startu też się wyróżnia jakąś konkretną sekwencją. Sekwencja konsensusowa miejsca startu (inicjator, INR) u człowieka to: 5’ - Y Y A N W Y Y - 3’ pierwszy nukleotyd ulegający transkrypcji (A - pierwszy nukleotyd w pre-mRNA) Y = T lub C; W = T lub A
TYLKO 24% promotorów zawiera kasetę TATA. TYLKO 46% promotorów zawiera sekwencję INR a spośród nich 35% ma kasetę TATA. • większość genów niemających kasety TATA należy do tzw. „housekeeping genes” – czyli genów podstawowego metabolizmu; • większość genów, które mają kasetę TATA charakteryzuje się regulowaną ekspresją • minimalny inicjator – YR (pirymidyna a następnie puryna jako • pierwszy nukleotyd ulegający transkrypcji
Ważniejsze elementy promotora eukariotycznego BREu - TFIIBrecognition element – upstream BREd - TFIIBrecognition element – downstream MTE - motif ten element DPE - downstream core promoter element
Polimeraza RNA II • Kompleks 12 podjednostek (RPB 1-11, RBC 10) • Łączna masa cząsteczkowa – ok. 600 kDa • Ale to nie polimeraza rozpoznaje promotory genów
Podjednostki polimerazy RNA II (u człowieka) Na żółto zaznaczono podjednostki wspólne dla wszystkich trzech polimeraz RNA. Polimeraza RNA I – 14 podjednostek (białka RPA) Polimeraza RNA III –15 podjednostek (białka RPC)
Polimeraza RNA II C-koniec www.steve.ab.com/science/transcription.html
W skład kompleksu inicjującego transkrypcję wchodzą powszechne (podstawowe) czynniki transkrypcyjne (ang. general (basic) transcription factors). Nazewnictwo podstawowych czynników transkrypcyjnych TFIIA transcription factor kolejny czynnik z którą polimerazą współdziała
INICJACJA TRANSKRYPCJI • TFIID łączy się z DNA. • TFIID składa się z kilkunastu • podjednostek. • Jedną z nich jest białko TBP • (białko wiążące kasetę TATA). • TBP rozpoznaje kasetę TATA • i wiąże się z nią z wysokim • powinowactwem. TBP – (ang. TATA-box binding protein). Pozostałe podjednostki nazywają się TAF (ang. TBP-associated factors)
Kompleks TBP z DNA Molecular Biology of the Cell Alberts et al., 2002 Związanie TBP do małego rowka wywołuje w DNA duże zmiany konformacyjne rozplecenie i zagięcie.
TBP – białko wiążące kasetę TATA (ang. TATA-box binding protein) Ciekawostka: N-MDQNNSLPPYAQGLASPQGAMTPGIPIFSPMMPYGTGLTPQPIQNTNSLSILEEQQR QQQQQQQQQQQQQQQQQQQQQQQQQQQQQQQQQQQQQQAVAAAAVQQSTSQQATQGTSGQAPQLFHSQTLTTAPLPGTTPLYPSPMTPMTPITPATPASESSGIVPQLQNIVSTVNLGCKLDLKTIALRARNAEYNPKRFAAVIMRIREPRTTALIFSSGKMVCTGAKSEEQSRLAARKYARVVQKLGFPAKFLDFKIQNMVGSCDVKFPIRLEGLVLTHQQFSSYEPELFPGLIYRMIKPRIVLLIFVSGKVVLTGAKVRAEIYEAFENIYPILKGFRKTT-C • Domena poliglutaminowa reguluje zdolność C-końcowej domeny do wiązania DNA. • TBP jest kodowane przez gen polimorficzny – liczba Q (glutaminy) od 25-42. Gdy ilość większa (47 – 63) ataksja móżdżkowo-rdzeniowa 17 (ang. spinocerebellar ataxia 17; SCA17) • Inną dziedziczną chorobą wywołaną zwiększeniem liczby powtórzeń Gln (czyli trójek CAG jest choroba Huntingtona, mutacja w genie huntingtiny).
TBP oddziałuje z kasetą TATA a inne podjednostki kompleksu TFIID (TAF1 i TAF2) oddziałują z sekwencją inicjatora TAF = TBP-associated factor Przyłączają się kolejne podjednostki kompleksu inicjatorowego transkrypcji: TFIIA, TFIIB, polimeraza TFIIF, TFIIE, TFIIH i CAK (kinaza).
Po kolei: Do TFIID przyłącza się TFIIA • TFIIA - heterotrimer (podjednostki: 35; 19 i 12,5 kDa). • Oddziałuje z TBP i stabilizuje tworzący się kompleks.
Następnie przyłącza się TFIIB Pojedynczy łańcuch polipeptydowy (35 kDa). Łączy się z kompleksem TFIID•TFIIA tworząc kompleks potrójny: TFIID•TFIIA•TFIIB (kompleks DAB) TFIIB – oddziałuje ze specyficznymi sekwencjami DNA – BRE (TFIIBrecognition elements) obecnymi w niektórych promotorach (sekwencje otaczające sekwencję TATA)
Następniedo kompleksu DAB przyłącza się polimeraza RNA II oraz TFIIF (kompleks) • Heterodimer - podjednostki: 74 i 30 kDa. Ma aktywność kinazy białkowej – ulega autofosforylacji. • Funkcja - istotny dla: • wyboru miejsca startu transkrypcji, • właściwej orientacji DNA względem kompleksu białek w obrębie promotora, • uwalniania polimerazy z promotora.
Następuje przyłączenie czynnika TFIIE Tetramer: 2 łańcuchy a - 50 kDa i 2 łańcuchy b -33 kDa Rekrutuje TFIIH oraz stymuluje aktywność kinazy fosforylującej polimerazę RNA II.
Przyłącza się kompleks TFIIH + CAK • TFIIH: 6 podjednostek • 62; 44; 34; 52; 89; 80 kDa • TFIIH tworzy kompleks z • CAK (kinaza aktywująca kinazy • zależne od cykliny; ang. CDK • activating kinase). • CAK = CDK7 + cyklina H + MAT1 • CDK7 – podjednostka CAK • odpowiedzialna za fosforylację • polimerazy RNA II Uwaga: TFIIH uczestniczy także w procesach NER
Kompleks TFIIH i CAK pełni 3 funkcje: • Wiąże się do matrycowego DNA (wskazuje, która nić DNA ma być przepisana • Jest helikazą, rozplata fragment DNA. • Fosforyluje C-końcową domenę polimerazy – co oznacza koniec inicjacji, początek elongacji. • Aktywność TFIIH silnie zależy od jego interakcji z TFIIE.
Kompleks polimerazy RNA II i podstawowych czynników transkrypcyjnych Numery oznaczają kolejność przyłączania się do kompleksu Lokalizacja poszczególnych białek nie jest zachowana na rysunku
1593 N-......YSPTSPAYEPRSPGGYTPQSPSYSPTSPSYSPTSPSYSPTSPN YSPTSPSYSPTSPSYSPTSPSYSPTSPSYSPTSPSYSPTSPSYSPTSPS YSPTSPSYSPTSPSYSPTSPSYSPTSPSYSPTSPSYSPTSPSYSPTSPS YSPTSPSYSPTSPNYSPTSPNYTPTSPSYSPTSPSYSPTSPNYTPTSPN YSPTSPSYSPTSPSYSPTSPSYSPSSPRYTPQSPTYTPSSPSYSPSSPS YSPTSPKYTPTSPSYSPSSPEYTPTSPKYSPTSPKYSPTSPKYSPTSPT YSPTTPKYSPTSPTYSPTSPVYTPTSPKYSPTSPTYSPTSPKYSPTSPT YSPTSPKGSTYSPTSPGYSPTSPTYSLTSPAISPDDSDEEN - C 21 sekwencji – 100% zgodność z sekwencją konsensusową YSPTSPS (kolor czerwony i niebieski) 31 sekwencji – niepełna zgodność (kolor zielony) Budowa domeny C-końcowej (CTD) największej podjednostki polimerazy RNA II
Fosforylacja reszt seryny w sekwencjach YSPTSPS w obrębie CTD polimerazy RNA II umożliwia odłączenie kompleksu polimerazy od promotora i zapoczątkowanie elongacji RNA Domena CTD jest także zaangażowana w procesy obróbki RNA – dołączanie czapeczki, dołączanie ogona poli-A, składanie RNA. Aktywność CTD w tych procesach jest regulowana wzorem fosforylacji. CTD stanowi platformę dla białek uczestniczących w tych procesach.
5’-UTR(ang. untranslated region)– kilkadziesiąt – kilkaset nukleotydów Sekwencja kodująca(przeciętnie) - 1000 – 2000 nukleotydów (max. 114 000, tityna) 3’-UTR– kilkadziesiąt – 2000 nukleotydów poli A– 30 – 250 nukleotydów
Budowa czapeczki 5’ trifosfataza polinukleotydowa + transferaza guanylilowa (CE) metylotransferaza guaninowa metylotransferaza 2O’-rybozy 5’ – 5’
Przyłączanie czapeczki Czapeczka przyłączana jest do RNA zaraz po rozpoczęciu transkrypcji (< niż 30 n). Enzym przyłączający czapeczkę (CE, capping enzyme) oraz metylotransferaza guaninowa (MT) oddziałują z ufosforylowaną domeną CTD polimerazy RNA II.
Zakończenie transkrypcji Sekwencja bogata w U (USE) może, ale nie musi występować
CPSF – ang. cleavage and polyadenylation specificity factor CSTF – ang. cleavage stimulation factor, trimer
Istnienie intronów można zaobserwować Nagroda Nobla za odkrycie intronów (1993) Richard J. Roberts Phillip A. Sharp (1977)
Inne potwierdzenie: Doświadczenie „pulse-chase” badające wbudowywanie znakowanego trifosforanu urydyny do RNA początkowo radioaktywność znajduje się w znacznie większych cząsteczkach RNA niż dojrzały RNA. Jeszcze inne potwierdzenie: Porównanie sekwencji DNA i cDNA (sekwencjonowanie). W wyniku transkrypcji powstaje hnRNA (ang.heterogeneousnuclear RNA)
Składanie mRNA Gen globiny - 1525 pz: 622 w egzonach, 893 w intronach Gen owoalbuminy - 7500 pz: 8 krótkich egzonów (1858 pz) Gen owotransferyny – 10 000 pz: 10 krótkich egzonów (2200 pz) http://courses.agri.huji.ac.il/71065/14/images/b-02-intron-exon-mosaic.jpg
Skrajności: Geny ssaków kodujące histony i interferony klasy I nie mają intronów Gen titiny (konektyny) ma 362 introny Tityna to największe znane białko (jeden łańcuch polipeptydowy) – blisko 27 000 aminokwasów (przeciętne białko ma 500 aa).
W trakcie transkrypcji syntetyzowany RNA jest włączany w kompleksy białkowe tworzą się splajsosomy. W splajsosomach dochodzi do wycinania intronów i składania mRNA. W skład splajsosomów wchodzą różne snRNP („snurps”; ang. small nuclear ribonucleoproteins). Każdy snRNP to kompleks kilku lub kilkunastu łańcuchów polipeptydowych i krótkiego RNA (snRNA, przeciętnie 100 - 200 n). snRNA oraz snRNP, w skład których wchodzą dane snRNA oznacza się U1, U2, U3 itd.
snRNP zawierają takie podjednostki białkowe, które są wspólne dla kilku różnych snRNP i takie które są specyficzne tylko dla danego snRNP. Np. Dla U1, U2, U4/U6, i U5 są wspólne następujące polipeptydy SNRP (Sm) : B, D1, D2, D3, E, F i G. Tworzą one rdzeń (pierścień) do którego dołączają się inne, specyficzne łańcuchy (np. dla U1 to białka U1-A; U1-70K, U1-C). snRNP rozpoznają połączenia intron-egzon (egzon-intron) i prowadzą reakcje składania mRNA
U1-A U1-70K kompleks białek Sm U1-C U1-snRNA Stark H et al. Nature. 2001 409, 539-42
Miejsca wycinania intronów są precyzyjnie określone przez sekwencje nukleotydów na granicach: egzon-intron oraz intron-egzon. Długość intronu: 50 – 10 000 nukleotydów Najkrótszy - 25 nukleotydów* Najdłuższy – 55 000 nukleotydów* takie wartości udało mi się znaleźć w literaturze
miejsce splajsingowe 5’ miejsce rozgałęzienia miejsce splajsingowe 3’ Wielkość liter odpowiada prawdopodobieństwu występowania określonego nukleotydu w określonej pozycji. http://www.mskcc.org/mskcc/_assets/content-image/56182.gif
Wycinanie intronów i składanie mRNA zachodzi w wyniku dwóch reakcji transestryfikacji W przypadku składania mRNA transestryfikacja zachodzi nie między dwoma różnymi cząsteczkami a pomiędzy fragmentami tej samej cząsteczki.
związek pośredni w kształcie lassa
Oddziaływanie snRNA z miejscami na granicy intron-egzon Sm – konserwatywne miejsce przyłączania białek Sm do snRNA www2.uah.es/biomolq/BM/Esquemas/Tema14.htm
U2 i U6 tworzą wspólnie centrum katalityczne splajsosomu. Ich snRNA zawierają odcinki częściowo komplementarne.
U4 snRNA i U2 snRNA są częściowo komplementarne z U6 snRNA w U4/U6 snRNP U2/U6 w splajsosomie http://www.biomedcentral.com/content/figures/1471-2199-6-20-5.gif
Istnieją introny, które mogą same się wycinać: Grupa I: -w genomie mitochondrialnym niektórych grzybów -w genomie chloroplastów -w genomie jądrowym niższych eukariontów (np. orzęski) Grupa II: -w genomie mitochondrialnym drożdży i niektórych innych grzybów – np. introny w mRNA kodującym cytochrom b i podjednostki oksydazy cytochromowej -w genomie chloroplastów rRNA mRNA W autosplajsingu biorą udział białka - maturazy
Nagroda Nobla z Chemii 1989"for their discovery of catalytic properties ofRNA" Sidney AltmanThomas R. Cech (odkrycia z 1981/82)
Składanie autokatalityczne przez introny grupy I Kluczowa rola guanozyny lub nukleotydów guanozynowych (GMP, GDP, GTP)