Joaquim Maurício DUARTE-ALMEIDA, Ricardo José dos SANTOS, Maria Inês GENOVESE, Franco Maria LAJOLO

1. AVALIAÇÃO DA ATIVIDADE ANTIOXIDANTE UTILIZANDO SISTEMA β-CAROTENO/ÁCIDO LINOLÉICO E MÉTODO DE SEQÜESTRO DE RADICAIS DPPH Joaquim Maurício DUARTE-ALMEIDA, Ricardo José dos SANTOS, Maria Inês GENOVESE, Franco Maria LAJOLO Ciênc. Tecnol. Aliment., Campinas, 26(2): 446-452, abr.-jun. 2006

2. Radicais de oxigênio e ânion superóxido → papel importante nas reações bioquímicas/fisiológicas do corpo humano; • Produção excessiva processos patofisiológicos ou fatores ambientais adversos falta de antioxidantes disponíveis in vivo podem ocorrer doenças e danos profundos em tecidos Introdução:

3. ANTIOXIDANTES → retardam a velocidade da oxidação, através de um ou mais mecanismos, tais como inibição de radicais livres e complexação de metais; • Compostos fenólicos potentes antioxidantes • Acerola → ácido ascórbico • Morango, amora e açaí → determinados grupos de flavonóides como antocianinas, flavonóis e flavonas Introdução:

4. MÉTODO DE OXIDAÇÃO DO Β-CAROTENO/ÁCIDO LINOLÉICO avalia a atividade de inibição de radicais livres gerados durante a peroxidação do ácido linoléico O método está fundamentado em medidas espectrofotométricas da descoloração (oxidação) do β-caroteno induzida pelos produtos de degradação oxidativa do ácido linoléico Introdução:

5. A proposta do presente trabalho foi avaliar a atividade antioxidante de compostos puros e extratos de frutas, por meio de dois métodos, com o objetivo de otimizar a velocidade de aquisição de dados, reduzindo também as quantidades de reagentes e de amostras. Objetivo:

6. Frutos in natura açaí (Euterpe oleracea Martius) acerola (Malpighia glabra L.) amora (Rubus L.) e morango (Fragaria x ananassa Duch.) adquiridos na Ceagesp (Companhia de Entrepostos e Armazéns Gerais de São Paulo) estágio maduro prontos para consumo Materiais e Métodos:

7. Após os frutos serem lavados em água corrente, foram cortados em pedaços, imediatamente congelados em nitrogênio líquido e armazenados em freezer a -80ºC até o momento das análises, quando foram triturados e homogeneizados em gral com pistilo, sob nitrogênio líquido; • Preparo dos extratos dos frutos: • extração realizada em duplicata; • homogeneizou-se 1 g de amostra + 20 mL de metanol 70% em Ultra-Turrax por 1 min em velocidade média, em banho de gelo; • filtrado em papel de filtro Whatman nº 6. • refiltrado e os extratos obtidos foram reunidos, ajustando-se o volume final para 50 mL com metanol 70%. Materiais e Métodos:

8. Determinação da atividade antioxidante utilizando-se sistema β-caroteno/ácido linoléico: • Mistura reativa →20 μL de ácido linoléico + 200 mg de Tween 40 + 25 μL de solução de β-caroteno a 2 mg/mL em clorofórmio + 500 μL de clorofórmio em erlenmeyer Completa evaporação do clorofórmio sob N2 adicionou-se 25 mL de água previamente saturada com oxigênio durante 30 min agitou-se vigorosamente Materiais e Métodos:

9. Determinação da atividade antioxidante utilizando-se sistema β-caroteno/ácido linoléico: • Mistura reativa límpida com absorbância entre 0,6 e 0,7 em 470 nm; • Determinação das absorbâncias → microplaca de poliestireno com 96 cavidades (λentre 340 e 800 nm); • Cada cavidade da microplaca → 250 μL mistura reativa + 10 μL de metanol (controle) ou o mesmo volume para as soluções padrão ou extratos das amostras; Materiais e Métodos:

10. Determinação da atividade antioxidante utilizando-se sistema β-caroteno/ácido linoléico: • Placa incubada 45ºC (acelerar as reações de oxidação e iniciar o descoramento do β-caroteno); • Leituras realizadas imediatamente e com intervalos de 15 min, durante 120 min, em espectrofotômetro de microplaca Benchmark Plus; • As curvas foram preparadas com 100, 200, 300, 400, 500 e 600 μmoles de ácido ascórbico, 25, 50, 100, 150 e 200 μmoles de BHA e BHT e 150, 300, 450, 600 e 750 μmoles de quercetina. Materiais e Métodos:

11. Determinação da atividade antioxidante utilizando-se sistema β-caroteno/ácido linoléico: • Resultados foram expressos como porcentagem de inibição da oxidação, que foi calculada em relação ao decaimento da absorbância do controle (Ac); • A queda da absorbância das amostras (Aam) foi correlacionada com a queda do controle, obtendo-se a porcentagem da inibição da oxidação (% I) através da equação: Materiais e Métodos:

12. Determinação da atividade antioxidante utilizando-se sistema β-caroteno/ácido linoléico: • Eficiência do antioxidante → valores de F1 e F2 (YANISHILIEVA & MARINOVA) calculados a partir da curva de oxidação (abs470 nm x tmin) • Eficiência em bloquear a reação em cadeia (interação com os radicais peróxidos)→ mensurada na primeira parte da curva (15 e 45 min) • A relação entre as tangentes das curvas da solução padrão e do controle expressa a eficiência do antioxidante (F1) (Equação 2): Materiais e Métodos:

13. Determinação da atividade antioxidante utilizando-se sistema β-caroteno/ácido linoléico: • Possibilidade de o antioxidante participar de outras reações durante o processo oxidativo → medida durante a segunda parte da curva (75 e 90 min) (F2): Materiais e Métodos:

14. Determinação da atividade antioxidante através do método de seqüestro de radicais livres (DPPH): • ATIVIDADE ANTIOXIDANTE → capacidade dos antioxidantes em seqüestrar o radical DPPH • Foi utilizado metanol como CONTROLE e BHA, BHT, ácido ascórbico, ácido clorogênico e quercetina como PADRÕES; • Decaimento da absorbância das amostras (Aam) correlacionado ao decaimento da absorbância do controle (Ac) → porcentagem de seqüestro de radicais livres (% SRL), que pode ser expressa através da equação: Materiais e Métodos:

15. Determinação da atividade antioxidante pelo sistema β-caroteno/ácido linoléico com microplaca de poliestireno e DPPH→ expressiva redução do uso de reagentes e de amostras (95%); • Sistema β-caroteno/ácido linoléico → leituras no leitor de microplaca são automáticas e seqüenciais → maior precisão e não requer a presença do analista durante o ensaio; • Determinação da atividade antioxidante pelo sistema β-caroteno/ácido linoléico: • BHA e BHT → ampla utilização na indústria alimentícia; • QUERCETINA e ÁCIDO ASCÓRBICO → normalmente presentes em frutas e vegetais; Resultados e discussão:

16. Resultados e discussão:

17. Resultados e discussão:

18. Após o Ác. Ascórbico doar os 2 H redutores, ficou passível de receber elétrons, devido ao radical ascorbila formado, que é um agente oxidante • ÁCIDO ASCÓRBICO → conhecido por sua atividade antioxidante e por isso é utilizado em cosméticos ou em tratamentos de doenças degenerativas; Resultados e discussão:

19. Compostos fenólicos → antioxidantes e capazes de exercer seu papel biológico → [ ] ↓ capazes de impedir, retardar e prevenir a auto-oxidação ou oxidação mediada por radicais livres e que o produto formado após a reação seja estável; Resultados e discussão:

20. Maior percentagem de inibição em menor concentração Estrutura semelhante a quercetina, mas com glicosídeo na OH → Menoratividade ↓ atividade antioxidante → poucas OH redutoras Resultados e discussão:

21. Compostos fenólicos → antioxidantes e capazes de exercer seu papel biológico → [ ] ↓ capazes de impedir, retardar e prevenir a auto-oxidação ou oxidação mediada por radicais livres e que o produto formado após a reação seja estável; • Valores de F1 e F2 próximos de 1 → menor atividade antioxidante; • F1 → ação sobre o BLOQUEIO DE PERÓXIDOS; • F2 → ação antioxidante em outras reações durante a oxidação; Resultados e discussão:

22. Resultados e discussão:

23. Resultados e discussão:

24. Atividade antioxidante através do método de seqüestro de radicais livres (DPPH) • Transferência de elétrons de um composto antioxidante para o DPPH, que ao se reduzir perde sua coloração púrpura; • Avalia apenas o poder redutor do antioxidante → não detecta substâncias pró-oxidantes; Resultados e discussão:

25. Radical ascorbila não interfere na reação nesse sistema → Ação antioxidante • Maior porcentagem de seqüestro de radicais livres em comparação ao BHA e o BHT. Resultados e discussão:

26. Menor atividade em ambos os sistemas • Menor atividade que acerola e amora nesse sistema • Maior porcentagem de seqüestro de radicais livres → ácido ascórbico → ação antioxidante Resultados e discussão:

27. Atividade antioxidante dos extratos das frutas mostrou-se de acordo com a dos padrões analisados; • Sistema β-caroteno/ácido linoléico → extrato de ACEROLA comportou-se como PRÓ-OXIDANTE e o AÇAÍ, a AMORA e o MORANGO comportaram-se como ANTIOXIDANTES; • Seqüestro de radicais livres (DPPH) → extrato de ACEROLA apresentou a maior atividade antioxidante, seguido pelos extratos de AMORA, AÇAÍ e MORANGO; • ÁCIDO ASCÓRBICO → comportamento relacionado nos dois sistemas; Conclusões:

28. Adaptações dos métodos utilizando microplacas permitiram a realização de múltiplas análises, minimizaram o uso de reagentes e reduziram significativamente a quantidade de amostra necessária; • A automatização das leituras de absorbância simplificou e reduziu o tempo e o trabalho despendido pelo analista, proporcionando também grande precisão nos resultados. Conclusões: