Acidi nucleici – 5

1. Acidi nucleici – 5 presentazione del prof. Ciro Formica Immagini e testi tratti dai website di: genome.wellcome.ac.uk, dnaftb.org, unipv.it, unimi.it, wikipedia.it, unibs.it, unina.it, uniroma2.it, nih.gov, zanichelli.it, sciencemag.org

2. 1- La reazione a catena della polimerasi/Polymerase Chain Reaction – PCR2- Gli enzimi di restrizione3- L’estrazione del DNA eucariote

3. DNA polimerasi

4. Kary Mullis, USA, 1944-vivente Biochimico USA, Nobel per la Chimica nel 1993 per aver sviluppato e migliorato –nell’83- la tecnica PCR – Polymerase Chain Reaction, che era stata già introdotta da Khorana (Nobel ’68). Ha studiato e lavorato a Berkeley ed è considerato uno scienziato eccentrico. Beliefs (convinzioni): Science, like nothing else among the institutions of mankind, grows like a weed every year. http://www.karymullis.com/pcr.shtml

5. Componenti della PCR (1986) • DNA stampo; • tampone specifico di reazione contente sali; • primers (oligonucleotidi) specifici; • deossinucleotiditrifosfati (dATP, dCTP, dGTP e dTTP); • Taq polimerasi, enzima ad attività DNA Polimerasi ricavato da Thermusaquaticus (Taq), attività 5’3’. Non ha attività esonucleasica 3’ 5’. Caratteristiche: termoresistenza, specificità, fedeltà (1 nt sbagliato ogni 2x104) • Thermusaquaticus batterio termofilo isolato per la prima volta nelle pozze di acqua calda del parco nazionale di Yellowstone, negli Stati Uniti. • La reazione avviene in un termociclatore con un blocco di alluminio che può essere riscaldato e raffreddato rapidamente

6. Taq Polymerase Il Grand Prismatic Spring nello Yellowstone Park (USA). Il colore si deve alla presenza dei batteri termofili

7. I cicli della PCR + II ciclo III ciclo denat. T = 94°C denaturazione anneal. denaturazione exten. T = 72°C nuovo DNA 23 = 8 8 molecole di DNA in 3 cicli

8. Schema generale della PCR

9. Animazioni della PCR http://users.ugent.be/~avierstr/principles/pcr.html http://www.dnalc.org/view/15475-The-cycles-of-the-polymerase-chain-reaction-PCR-3D-animation-with-no-audio.html

10. Gli enzimi di restrizione -rompono i legami fosfodiesterici tra i nucleotidi -riconoscono sequenze specifiche, in genere di 4-6 nucleotidi, di DNA a doppio filamento. -le sequenze sono generalmente palindromi, cioè identiche se lette in direzione 5'--> 3' sia su un filamento che sull'altro. -servono a tagliare il DNA in modo preciso e prevedibile -sono stati isolati più di 1200 enzimi da procarioti -riconoscono più di 130 diverse sequenze nucleotidiche (sequenze palindromiche di 4, 6 o 8 nucleotidi). Il loro nome deriva dal batterio da cui sono stati isolati: EcoRI: E. coli  sequenza GAATTC/CTTAAG BamHI : Bacyllus amyloliquefaciens: GGATCC/CCTAGG

11. Scoperta del primo enzima di restrizione (1970)prima molecola di DNA ricombinante, Paul Berg (1972)

12. Tipi di taglio • -BLUNT ENDS O TAGLIO NETTO • Es. SmaI • 5’-CCC GGG-3’ 5’-CCC-3’ 5’- GGG-3’ • 3’-GGG CCC-5’ 3’-GGG-5’ 3’-CCC-5’ • -STICKY ENDS O CODINE ADESIVE: • -5’ PROTRUDING (5’ SPORGENTE) • -3’ PROTRUDING (3’ SPORGENTE) • Es. Eco RI (5’ PROTRUDING) • 5’-G/AATTC-3’ 5’-G-3’ 5’-AATTC-3’ • 3’-CTTAA/G-5’ 3’-CTTAA-5’ 3’-G-5’ • Es. Kpn I (3’ PROTRUDING) • 5’-GGTAC/C-3’ 5’-GGTAC -3’ 5’-C-3’ • 3’-C/CATGG-5’ 3’-C-5’ 3’-CATGG-5’

13. Estrazione del DNA eucariote Scopo dell’esperienza: Estrarre il materiale genetico da un organismo vegetale Materiale occorrente • Reagenti • Etanolo assoluto • Acido acetico glaciale • acido cloridrico diluito • cloruro di sodio • succo di ananas • rosso fenolo • blu di metilene/toluidina • 1-2 banane o kiwi • detergente liquido per piatti • ghiaccio

14. Estrazione del DNA: procedura • Raffreddare con ghiaccio in becher da 1000 un volume pari a 100 mL di etanolo • Miscela n. 1 (becher 100 mL): 10 g. NaCl, 10 ml detergente liquido, 90 ml acqua demineralizzata • Miscela n. 2 (becher 100 mL): 5 mL di succo d’ananas, 95 mL acqua demineralizzata • Sbucciare e tagliare kiwi o banane, pestarli nel mortaio, aggiungere 10 mL di soluzione 1, mescolare, versare in un becher da 100 – scopo: allontanare proteine e carboidrati • Porre il becher a bagnomaria a 60°C per 15 minuti (termometro) • Subito dopo porre in ghiaccio (becher da 1000) per 5 min con una bacchetta di vetro ridurre in poltiglia • Filtrare e suddividere il filtrato in 3-4 provette • Aggiungere a ciascuna provetta 3-4 mL di miscela 2. Scopo: la bromelina dell’ananas è una proteasi atta a demolire le proteine istoniche, il che favorisce la purificazione del DNA

15. 10 Aggiungere 10 mL di etanolo freddo. Si formeranno 2 fasi, da non mescolare e far riposare per 10 min a temperatura ambiente 12 In etanolo a freddo precipitano gli acidi nucleici, che verranno estratti con la bacchetta di vetro e posti in un tubo 13 Per evidenziarli meglio si aggiungono 5 gocce di rosso fenolo, che farà colorare il materiale genetico

16. ingredienti

17. Bagnomaria e filtrazione

18. Fase finale: il DNA è estratto