Neurochemie: Neurop ř ena š e č e: neuropeptidy a puriny 6. přednáška

1. Neurochemie: Neuropřenašeče: neuropeptidy a puriny 6. přednáška

2. Purinergní neuropřenašeče, zejména adenosin a ATP, nebyly v rámci přenosu nervového impulsu dlouho vůbec uvažovány. • úloha neuropeptidů v CNS spíše modulační • fungují jako neuropřenašeče, ale mnoho jejich dalších funkcí zatím neobjasněno • především látky centrálně zapojené do intermediátního metabolismu • přesto koncentrovány na určitých typech synapsí a po patřičném stimulu se z nich uvolňují, aby vyvolaly patřičnou odpověď NEUROPEPTIDY • malé molekuly složené z aminokyselin navzájem kovalentně propojených peptidickou vazbou • neuropeptidy je rezervován pro malé proteiny, které mají neurotransmiterům podobnou funkci v rámci nervového systému (De Vied 1969) • neuropeptidy = malé proteiny, které mají neurotransmiterům podobnou funkci v rámci nervového systému (CNS i PNS) • nejen neuropřenašeče: některé jsou neurony uvolňovány přímo do krevního řečiště a slouží jako hormony • jiné jako hormony uvolňovány endokrinními žlázami • popsána zatím asi stovka

3. Progress in Brain Research, Vol. 72, Chapter 9, David de Wied

4. Prekurzorové proteiny  syntéza neuropeptidu vyžaduje transkripci DNA, její přepis do mRNA a tvorbu proteinu  proteinový produkt uvolněný z ribosomu = velký prekurzorový polypeptid vyžadující posttranslační úpravy (prepropeptid)

5. Klasifikace neuropeptidů • tradičně se dělí do skupin podle oblastí, ve kterých byla jejich funkce poprvé popsaná, nebo podle svého účinku nepřesné: ACTH a a-MSH se nachází nejen v neurohypofýze, ale i non- neuroendokrinních neuronech a mají i non-neuroendokrinní funkce mohou koexistovat s „klasickými“ neuropřenašeči

6. Prekurzorové proteiny  syntéza neuropeptidu vyžaduje transkripci DNA, její přepis do mRNA a tvorbu proteinu proteinový produkt uvolněný z ribosomu = velký prekurzorový polypeptid vyžadující posttranslační úpravy (prepropeptid) Vznik a zpracování prepropeptidu proopiomelanokortinu (POMC)  POMC = prekurzor mnoha aktivních peptidů jeho produkty zahrnují např. adrenokortikotropní hormon (ACTH), a-melanocyty-stimulující hormon nebo b-endorfin prepropeptid obsahuje N-koncovou signální sekvenci (nasměruje nově vzniklý protein z ribosomů do lumen ER) po transportu do ER signální sekvence odštěpena signální peptidasou vzniká propeptid propeptid je přenesen do Golgiho aparátu uskladněn do velkých denzních váčků v těch dále zpracováván ve váčcích z těla buňky transportován na synapsi

7. Proteolytické zpracování  propeptidové prekurzory konvertovány na aktivní neuropeptidy sérií kroků zahrnuje štěpení konvertasami a modifikaci na specifických aminokyselinových zbytcích  endoproteasy rozpoznávají a štěpí dibasické aminokyselinové páry (Lys-Arg, Lys-Lys, Arg-Arg nebo Arg-Lys) vzniklé peptidy jsou dále zpracovány exopeptidasami a různými modifikujícími enzymy fenomén zpracování prohormonů konvertasami popsán Donaldem F. Steinerem během studia vzniku insulinu (1967)  dva klíčové enzymy: konvertasa prohormonů 1 a 2 (PC1 a PC2) náleží do velké rodiny prohormonových konvertas zahrnující (zatím) 9 členů označovány též PCSK1-9, přičemž PSK1 = PC1 (PC3) a PCSK2 = PC2 postupují krokově, nejprve rozštěpí v závislosti na typu tkáně patřičný dibasický pár následně pokračují v dalších štěpeních  PC1 a PC2 štěpí různými způsoby POMC stejnou proteolytickou aktivitu vykazují na proinsulinu a proglukagonu v pankreatu PC2 hraje větší roli než PC1 v případě proinsulinu než proglukagonu PC1 je naopak pro štěpení glukagonu důležitější a méně využívaná pro štěpení proinsulinu než PC2 výsledek proteolytické aktivity PC1 i PC2 na POMC = malé peptidy, jejichž C nebo N konce obsahují lysinové nebo argininové zbytky PC1

8. Proteolytické zpracování karboxypeptidasa E pak odstraňuje C-koncové zbytky zatím neidentifikovaná aminopeptidasa odstraňuje zbytky N-koncové.  další úpravy po konvertasach a peptidasach: N-koncová acetylace, které často reguluje aktivitu neuropeptidu (zesílení biologické aktivity a-MSH nebo její pokles v případě b-endorfinu) peptidy obsahující C-terminální glycin: a-amidací pomocí enzymu peptidglycin a-amidující monooxygenasy (PAM); tento amidační krok podstupuje např. a-MSH  konvertasy prohormonů antagonisticky ovlivňují mnohé malé peptidy inhibitory angiotensin konvertujícího enzymu (ACE): captopril klinicky využíván v léčbě hypertenze (angiotenzin fyziologicky zvyšuje cévní tonus) nebo diabetické nefropatie Diversita neuropeptidů • jediný propeptid = několik bioaktivním neuropeptidům jednotlivé kroky proteolytického štěpení tkáňově specifické v předním laloku podvěsku mozkového POMC typicky konvertován na ACTH v intermediátním laloku a v neuronech produkujících POMC hlavními koncovými produkty a-MSH a b-endorfin tkáňově specifická exprese různých konvertas prohormonů konvertasy jsou vysoce citlivé na pH a Ca2+, jejich aktivita závisí i na změnách těchto parametrů uvnitř váčků

9. Diversita neuropeptidů • alternativní sestřih prvně zjištěn u kalcitoninu a kalcitoninovému genu příbuzného peptidu (calcitonin gene-related peptide, CGRP) tachykininy = produkce několika zástupců své rodiny alternativním sestřihem dvou preprotachykininových genů jeden z genů je alternativně sestřižen nejméně ve tři prepropeptidy, které dále posttranslačně produkuji pět rozdílných bioaktivních peptidů včetně neurokininu A a substance P Skladování a výlev  oproti např. acetylcholinu vznikají transkripcí, translací a dále jsou upravovány posttranslačně tyto procesy probíhají v somatu i axonu neuropeptidy obsaženy ve velkých denzních vesikulech skládaných v Golgiho komplexu a transportovaných na synapsi mnoho neuronů obsahuje v synaptickém zakončení OBA typy váčků neuropeptidy poměrně typicky kolokalizovány s „klasickými“ neuropřenašeči oba typy váčků uvolňovány odlišným mechanismem a často za jiných fyziologických podmínek a potřeb k výlevu neuropeptidů je potřeba delšího a většího zvýšení hladiny Ca2+ typický vzorec vzruchové aktivity může tedy vést k preferenčnímu výlevu jednoho nebo druhého typu neurotransmiteru, případně za sebou mohou následovat neuropeptidy modulují postsynaptický účinek klasických neuropřenašečů, a to buď stimulačně nebo inhibičně silně stimulovaných zakončení

10. Vzhledem k tomu, že k výlevu neuropeptidů je potřeba delší vzruchová aktivita, mohou pozitivní i negativní zpětnou vazbou regulovat aktivitu silně stimulovaných zakončení. Neuropeptidy vs. monoaminy

11. Neuropeptidová signalizace „na dálku“  oproti klasickým neuropřenašečům nejsou rychle odstraňovány ze synaptické štěrbiny deaktivace probíhá štěpením endoproteasami a exoproteasami lokalizovanými na extracelulárních membránách (nezaměňovat s konvertasami!)  mohou urazit značnou vzdálenost, než doputují ke svým receptorům (lokalizace mnoha neuropeptidů neodpovídá lokalizaci jejich receptorů) substance P vysoce koncentrována v substantia nigra, ale její receptory v této struktuře téměř chybí, zatímco v jiných částech mozku jsou detekovány hojně  většina receptorů pro neuropeptidy spřažena s G-proteiny mají pro své ligandy podstatně větší afinitu než receptory pro neuropřenašeče „klasické“ (ACh R afinita 100 mM – 1 mM, neuropeptidové Rs v řádu nanomolů)  interakce mezi neuropeptidy a jejich receptory je poměrně komplexní molekula noradrenalinu = jen těch několik atomů iontově nebo stericky interaguje s patřičným vazebným místem na odpovídajících receptoru, vs. interakce neuropeptidu Y (NPY) o délce 36 aminokyselin: jak se takové molekula vůbec „vejde“ do vazebného místa receptoru spřaženého s G-proteinem? Která konformace bude mít nejvyšší afinitu pro vazbu? Který aminokyselinový zbytek je pro vazbu kritický? A z kterého farmakologického pohledu mohou být připravovány nové látky, které budou dané vazebné místo antagonizovat nebo na něj budou působit agonisticky?  v praxi zatím v rovině modifikovaných peptidových analogů syntetické peptidy jsou degradovány různými peptidasami, neprochází skrze hematoencefalickou bariéru, užitečné v podpůrné léčbě poruch zasahujících CNS

12. Receptorové typy a subtypy  neuropeptidové receptory příliš početné  rozděleny do jednotlivých rodin některé neuropeptidy (TRH) se sice váží jen na jediný receptor, ale mnoho jiných (např. somatostatin) obsazuje až pět receptorových typů  v rámci každé receptorové rodiny vykazují jednotlivé subtypy receptorů své vlastní vzorce exprese v CNS i PNS CRF1R a CRF2R = dva receptory pro kortikotropin-uvolňující faktor (corticotropin- releasin factor, CRF) svou expresí alterují: tam, kde se vyskytuje jeden, není téměř detekovatelný ten druhý liší se afinitou k ligandům (CRF1R stejně silně váže CRF i příbuzný peptid urocortin, zatímco CRF2R má vyšší afinitu k urocortinu než CRF)  tato rozdílná distribuce má fyziologický význam  i další neuropeptidergní receptory mohou vázat víc než jeden peptid receptory melanokortinové rodiny = MC1-5 receptory každý z těchto receptorů může s různou potencí aktivovat ACTH, a-MCH a g-MCH MC4 receptor může být antagonizován také vzdáleně příbuzných endogenním peptidem nazvaným agouti-related peptid MC4 receptor = první receptor, u kterého byl v mozku nalezen endogenní agonista i antagonista.

13. Receptorové typy a subtypy

14. Receptorové typy a subtypy

15. Specifita receptoru pro ten který peptid je dána výhradně vnitřními vlastnostmi receptoru?  mnohé domény na extracelulárních i transmembránových doménách byly známy jako specifická vazebná místa pro určité ligandy:  proteiny modifikujících aktivitu receptoru (receptor activity modifying proteins, RAMPs):  ovlivňují transport CGRP receptoru do membrány a jeho glykosylaci podmiňují afinitu CGRP receptoru k příbuznému proteinu adrenomedullinu asi regulují funkce VIP, sekretinového a glukagonového receptoru (GPCRs skupiny B)  peptidergní receptory nejen na synapsi v menší míře i na plasmatické membráně axonů, těl neuronů i dendritů u některých subtypů je možná jejich extrasynaptická lokalizace primární po delší vazbě ligandu na tyto receptory spřažené s G-proteiny receptory internalizovány následně buď recyklovány, nebo degradovány výjimky: receptor pro neurotensin je i s navázaným ligandem transportován do těla neuronu a byl prokázán poblíž jádra nepotvrzeno, ale peptidergní receptory by mohly hrát i roli v kontrole genové transkripce RAMP1 (isoformy RAMp1-3)

16. Funkce neuropeptidů • u většiny malých neuropřenašečů popsána poměrně záhy (množství agonistů a antagonistů, kteří mohli mimikovat jejich působení, nebo naopak simulovat jejich nedostatek) v případě neuropeptidů množství těchto farmakologických nástrojů poněkud limitované jen někteří z peptidergních agonistů a antagonistů procházejí přes hematoencefalickou bariéru • stanovení tkáňové koncentrace neuroppetidů? pokud je neuronální aktivita inhibována, může koncentrace neuropeptidů v tkáni růst, protože neuropeptidy se v „tichých“ buňkách akumulují naopak, vyšší aktivita neuronů může vést až ke tkáňovému vyčerpání neuropeptidů vzrůst nebo pokles hladiny neuropeptidů? ... mikrodialýza alespoň umožňuje přesně a přímo změřit extracelulární koncentrace neuropeptidů ve vybraných mozkových oblastech •  většina prací zabývajících se funkcí neuropeptidů postavena na přímé injikaci neuropeptidů do specifických oblastí mozku či míchy pozorování fyziologických a behaviorálních změn tímto podáním vyvolaným injikované dávky jsou často miligramové, což je vzhledem k nannomolové afinitě neuopeptidergních receptorů nefyziologické, nicméně takto byly popsány první účinky neuropeptidů

17. JEDNOTLIVÉ SYSTÉMY NEUROPEPTIDŮ - opioidní peptidy • Opiodní peptidy jsou farmakologicky jedny z nejdůkladněji studovaných látek – primárně kvůli svým silným analgetickým vlastnostem, ale také kvůli svému působení proti kašli (antitussika) a průjmu (antidiarhoetika). • např. morfin byl užíván už v 19. století velká spotřeba opiátových analgetik spolu s rizikem vzniku závislosti na nich = vývoj opiátových farmak, která by závislost nezpůsobovala ani dnes sice nelze oddělit nejúčinnější analgetické vlastnosti opiátů od těch, které navozují závislost nicméně i tak objevení malých, lipofilních molekul jako naloxon a nalotrexon naloxon se užívá v léčbě předávkování opiátynalotrexon = jehož působení je déledobější, při léčbě závislostí na opitátech a při léčbě alkoholismu •  opioidní = spojeno s endogenními peptidy, které vykazují podobnou farmakologii jako opiát opiáty = morfin a jemu příbuzná nonpeptidová analoga • všechny známé opiodní peptidy jsou produkty tří velkých prekurzorových proteinů každý z nich je kódován vlastním genem: • POMC, z něhož jsou odvozeny ACTH, b-endorfin a několik nonopiodních petidů, • proenkefalin, z něhož pochází met-enkefalin a leu-enkefalin a • prodynorfyn, který je prekurzorem dynorfinu a jemu příbuzných proteinů naloxon

18.  opioidní peptidy sdílejí určité stejné aminokyselinové sekvence velmi často obsahují např. sekvenci čtyřech aminokyselin Tyr-Gly-Gly-Phe na svém N-konci, která bývá následována buď Met nebo leucinem morfinu podobné opiátové alkaloidy z opia pravděpodobně mimikují konformaci N-koncového tyrosinu endogenních peptidů • tři typy opiodních receptorů: m, k a d + NOR (orfaninový R, R pro nocicceptin) • pravděpodobně vznikají i jejich podtypym a d receptory jsou schopny formovat heterodimery receptory spřaženy s G-proteiny, konkrétně s Gi/o rodinou •  morfinu podobné opiáty se preferenčně váží na m receptory spojeny se sestupnými drahami bolesti (periakaveduktální šedá hmota, rostroventrální medulla, thalamus či zadní rohy míšní) i v jiných oblastech mozku (ventrální tegmentum, ncl. accumbens), kde jsou zodpovědné za zesílený efekt opiátům receptory se také vyskytují ve striatu (motorická kontrola) a locus coeruleus, ve kterém mohou vyvolávat mnohé somatické projevy závislosti na opiátech a opiátové abstinence nejdůležitější role v supraspinální analgesii vysoká afinita k benzomorfanové třídě opiodních látek (pentazocin) morfin pentazocin

19. JEDNOTLIVÉ SYSTÉMY NEUROPEPTIDŮ - Opiodní peptidy • d receptory jsou hlavními vazebnými partnery enkefalinů tyto receptory nejen z zadních kořenech míšních, ale i v oblastech mozku, které nejspíše nehrají v nocicepci žádnou úlohu klinické využití agonistů d receptorů zatím není známo • m receptory = preferenční vazebné místo endogenních opioidních peptidů b-endorfinyk receptory = vykazuje k nim nejvyšší afinitu dynorfin tyto peptidy se ovšem váží s různou afinitou ke všem třídám opiodních Rs • nociceptiny (orphaniny) = látky se zajímavými antiopioidní efekty váží se na receptory spřaženéné s G-proteiny, které vykazují vysokou míru homologie s receptory opioidními zvyšují vnímavost k bolestivým stimulům v hypothalamu, mozkovém kmeni, koncovém mozku, obou rozích míšních orphanin FQ17 AA

20. Kortikotropin uvolňující faktor (corticotropin-releasing factor (CRF)  CRF = peptid o délce 41 aminokyselin  prvně izolován jako hypothalalmický faktor napomáhající podobně jako vasopressin sekreci ACTH (sekvenován prvně u ovcí, 1981) syntetizován populací neuronů paraventrikulárního jádra hypothalamu odtud uvolňován do portálního spojení s hypofýzou nejen secernován do této portální cirkulace - neurony paraventrikulárního jádra hypothalamu projkují do různých mozkových struktur syntetizován také mimo hypothalamus, např. v centrálním jádře amygdaly  sekvence: SQEPPISLDLTFHLLREVLEMTKADQLAQQAHSNRKLLDIA  CRF uvolňovaný z amygadaly hraje kritickou roli v odpovědi mozku na stres zřejmě přispívá i ke vzniku pocitů strachu a úzkosti částečně zodpovědný za negativní projevy odvykacího syndromu závislých jedinců může být také zapojen do long-term deprese v mozečku  dva subtypy CRF receptorů. CRF1 R je široce exprimován v celém mozku. Jeho antagonisté mohou sloužit jako látky v terapii úzkosti a deprese. CRF2 R je koncentrován v bočních jádrech septa. Laterální septum je spojeno s emocemi, strachem a kognitivními funkcemi. Endogenním ligandem CRF2 R je urocortin (a urocortin II, jemu příbuzný).

21. Tachykininy  substance P, neurokinin A (NKA, dříve označovaný jako substance K) a neurokinin B (NKB), kassinin, eledoisin = tachykininy všechny tachykininy sdílejí stejnou C-koncovou sekvenci Phe-X-Gly-Leu-Met-NH2 substance P a NKA kódovány genem pro preprotachykinin A vznikají alternativním sestřihem NKB je kódován genem pro preprotachykinin B všechny známé tachykininové receptory jsou spřažené s Gq proteiny označovány jako NK1, NK2 a NK3 receptory  substance P vykazuje nejvyšší afinitu k NK1 receptoru, NKA preferenčně váže NK2 receptor a NKB zejména NK3 receptory

22. Substance P a neurokinin A substance P  substance P: už v 70. letech se věřilo, že by mohla být hlavním transmiterem nocicepce synapse primárních aferentních noiceptorů zadních kořenů míšních obsahují značné množství neuropeptidů, z nichž nejhojnější jsou calcitonin gene-related peptid (CGRP), ! substance P a NKA substance P v nocicepčních C vláknech kolokalizována s glutamátem její výlev z velkých denzních váčků vyžaduje silnější stimulus, než který by stačil pro klasický výlev glutamátu uvolňuje se i retrográdně z volných nervových zakončení nocicepčních neuronů přispívá k fenoménu neurogenního zánětu, při kterém interaguje s peptidem bradykininem  myši knock-outované pro NK1 receptor nebo gen pro preprotachykinin A: nevykazovaly projevy neurogenního zánětu, ale jejich nocicepce byla omezena jen v určitých nocicepčních drahách žádnou změnu oproti přirozenému fenotypu např. nevykazovaly v mechanické hypersenzitivitě navozené zánětem deficity v nocicepci vykazovaly jen při aplikaci nocicepčních stimulů se vzrůstající intenzitou Roli substance P v nocicepci tedy evidentně mohou přebírat i jiné nocicepční neuropřenašeče.  substance P a NK1 Rs se nacházejí v amygdale antagonista NK1 Rs v pokusech prováděných na mládětech morčat izolovaných od matky snižoval zvukové projevy jejich stresu antagonisté NK1 Rs testováni jako antidepresiva a anxiolytika; slibní i v léčbě chemotarapií navozené nausey (oproti antagonistům 5-HT3 receptorů (ondasetron) blokují nejen časnou, ale i pozdní fázi tohoto fenoménu)

23. Antagonisté NK1 Rs - ANTIEMETIKA Aprepitant • Antagonisté NK1 Rs: • potenciální analgetika • potenciální antidepresiva • potenciální hypnotika • možná role v etiologii bipolární poruchy (studie z r. 2008,Arch. Gen. Psychiatry65 (1): 53–61 )

24. Neurotensin (NT) • peptid o délce 13 aminokyselin vzniká z prekurozru obsahujícího také peptid neurotensinu podobný 6 aminokyselin) NT exprimován v mozku, nadledvinách a střevu, a to v mírně odlišných formách podle své tkáňové distribuce jeho C-konce obsahuje alternativně jednu ze tří Lys-Arg sekvencí, které jsou podle typu tkáně rozdílně štěpeny v mozku z prekurzoru vzniká NT a neuromedin N v nadledvinách vzniká delší forma neuromedinu N, neurotensin a jeho o něco delší štěpný produkt ve střevu vzniká NT a delší forma neuromedinu N  dva typy receptorů pro neurotensin : NTS1 a NTS2 receptory NTS1 mRNA je produkována v substantia nigra, ale ne ve striatu kupodivu, vlastní protein NTS1 receptorů se na dopaminergních terminálách striata nachází NT tak zřejmě moduluje dopaminergní transmisi exprese mRNA pro neurotensin je ve striatu vyvolaná antagonisty D2 receptorů, z nichž mnohé souží jako antipsychotika a nebo psychostimulační drogy (kokain, amfetamin) Byl naklonován i NTS2 receptor, ale jeho úloha zatím zůstává nejasná. neurotensin

25. Neuropeptid Y (NPY) • jedním s řady navzájem příbuzných peptidů, které tvoří rodinu pankreatických polypetidů 36 AA izlován r. 1982 jejími dalšími členy jsou pankreatický polypeptid (PP) a polypeptid YY (PYY) NPY je nejhojnějším neuropeptidem mozkové kůry koncentrován je i zadních rozích míšních a v hypothalamu v sympatiku i v CNS bývá kolokalizován s noradrenalinem • NPY a jemu peptidy se u savců váží na receptory označované Y1 až Y5(u lidí jen čtyři - Y1, Y2 , Y4, Y5) • receptory vykazují různou afinitu pro NPY, PP i PYY nacházejí se presynapticky i postsynapticky v různých oblastech mozku aktivace Y1 receptoru zřejmě souvisí s poklesem úzkostného chování, asi na úrovni amygdaly a kůry mozkové agonisté Y1 receptoru by mohla být slibná anxiolytika, a vykazují i určitý antinocicepční efekt naproti tomu aktivace Y5 receptoru vede ke zvýšení příjmu potravy (nejspíše na úrovni hypothalamu) antagonisté Y5 receptorů by tedy mohli být úspěšní v léčbě obezity NPY

26. PURINY Puriny nejsou jen stavebními kameny RNA a DNA, metabolickými kofaktory nebo druhými posly jako cAMP nebo cGMP. Hrají také důležitou roli v signalizaci mezi neurony. Biochemie purinů  dusíkaté heterocykly tvořené kondenzovaným pyrimidinovým a imidazolovým kruhem v purinergní transmisi využívány nukleosidové a nukleotidové deriváty samotného purinu v nukleových kyselinách jsou využívány dva purinové deriváty (adenin a guanin) v rámci signalizace mezi neurony využívány hlavně adenosin a ATP využíván i jim příbuzný je adenindinukleotid (ApnA) = molekula sestávající ze dvou adenosinů kovalentně spojených řetězcem dvou až šesti fosfátů.  na neurotransmisi se do určité míry mohou podílet i nukleotidové deriváty pyrimidinového typu guanin adenin

27. Skladování a výlev purinů  adenosin a ATP vykazují i odlišné vlastnosti  ATP a ApnA skladovány v malých synaptických váčcích a uvolňovány exocytosou navozenou depolarizací a vtokem Ca2+ do zakončení často jsou také detekovány ve stejných synaptických váčcích na stejné synapsi  adenosin uvolňován z nonvesikulárních cytoplasmatických zásob mimo cytoplasmu jej mohou uvolňovat obousměrné nukleosidové transportéry může vznikat rovnou v synaptické štěrbině, kam je uvolňován ve formě ATP a během sekundy metabolizován na membráně navázaná ectodiphosphohydrolasa konvertuje ATP na ADP a AMP AMP rozpustnou či s membránou asociovanou ecto-5´-nukleotidasou konvertován na adenosin výlev ATP tedy rovněž může být vydatným zdrojem extracelulárního adenosinu ApnA je hydrolyzován pomaleji a zůstává v synaptické štěrbině delší dobu Purinové transportéry  nukleosidové transportéry = k membráně vázané proteiny sloužící k přenosu purinových a pyrimidinových nukleosidů dovnitř a ven z mnoha typů buněk liší se svou substrátovou specifitou (jsou purin- nebo pyrimidinselektivní)  některé koncentrují nukleosidy v buňce v závislosti na Na+ jiné transportují nukleosidy ve směru jejich koncentračního gradientu

28. Purinové transportéry • jiné transportují nukleosidy ve směru jejich koncentračního gradientu farmakologicky bylo odlišeno nejméně sedm nukleosidových transportérů čtyři i klonováni u lidí 3 koncentrační transportéry (CNT - přenáší proti gradientu; AZT!) 4 ekvilibrační (ENT - po konc. gradientu), jejich inhibitory (dilazep) jsou vazodialtancia • farmakologie zahrnuje některé terapeuticky využitelné látky:• několik chemoterapeutik nádorového bujení (gemcitabin) a • silná antivirotika jako zidovudin (AZT) či Zalcitabin, užívané v léčbě AIDS obvykle nukleosidové analogy potenciálně i farmaka užitečná v léčbě neuropsychiatrických poruch Kredit:Mol Aspects Med. 2013 Apr-Jun;34(2-3):529-47

29. Charakteristiky některých purinových Rs • purinergní signalizace se objevuje už u bakterií, améb, bičíkovců, řas, hub, žahavců, žebernatek, ploštěnců, hlístic, korýšů, měkkýšů, kroužkovců, ostnokožců a hmyzu • u rostlin zvyšuje extracelulárně podané ATP a jiné nukleotidy cytoplasmatickou koncentraci vápníku, čímž ovlivňuje růst rostliny a její odpověď na různé stimuly

30. Purinové receptory Purinové receptory tvoří relativně velkou a různorodou skupinu proteinů, dělenou do dvou hlavních podskupin, označovaných jako P1 a P2 receptory. P1 receptory = adenosinové receptory A1, A2A, B a A3 P2 receptory = dvě rodiny zástupců • P2Y receptory spřažené s G-proteiny a • P2X receptory, které jsou ligandem ovládané iontové kanály P1 receptory = adenosinové receptory A1, A2A, B a A3 .  váží adenosin a jeho analoga spřaženy s G-proteiny vyklonovány čtyři subtypyA1 subtyp je nejrozšířenější v mozku a v páteřní míše nejvyšší afinitu vykazuje k adenosinu aktivace A1 subtypu  anxiolytické, antikonvulzivní, analgestické a sedační účinky adenosinu antagonisté A1 receptoru  stimulační efekty v nižších dávkách např. zvyšují pozornost (kofein), ve vyšších dávkách vyvolávají pocity úzkosti a podráždění kofein

31. A2 receptorů vyklonovány dva podtypy: A2A a A2B k adenosinu mají poněkud nižší afinitu než A1 receptor A2B receptory široce rozšířené v celém lidském těle jejich exprese v mozku a páteřní míše je ale nízká oproti nim jsou A2A receptory vysoce koncentrovány v zadním striatu, ncl. accumbens a čichovém laloku - třemi mozkovými oblastmi s dopaminergní inervací interakce dopaminu a adenosinu jsou v těchto oblastech popsány ve striatu agonisté A2A receptorů inhibují odpovědi navozené D2 receptory  naopak antagonisté je mimikují – i to přispívá se stimulačním účinkům kofeinu a jiných methylxanthinů antagonizací A2A Rs kofein redukuje klidový tok cerebrálními arteriemi o 22-30%  inverzní působení A2A a D2 receptorů by snad mohlo být užitečné v terapii Parkinsonovy choroby metabolity kofeinu

32. A3 receptor v nízkých hladinách exprimován v mozku  jeho funkce zatím není do detailů popsána • má neuroprotektivní i neurodegenerativní efekty, může posilovat buněčnou proliferaci i smrt • kardioprotektivní funkce během srdeční ischemie (selektivní agonista CP532,903) • antagonista SSR161421 by mohl být vhodný pro terapii bronchiálního astmatu • agonista CF-101 v klinických pokusech léčby revmatické artritidy (genericky IB-MECA, hotová je fáze II, stejně jako fáye II psoriatické studie) a tzv. syndromu suchého oka (keratoconjunctivitis sicca, fáze III) • ze všech adenosinových receptorů vykazuje k adenosinu nejnižší afinitu • zatímco A1 a A2 receptory váží adenosin s nanomolární afinitou, A3 receptor potřebuje mikromolární koncentrace

33. P2Y receptory spřažené s G-proteiny a  vyklonováno 14 P2Y receptorů váží difosfáty i trifosfáty purinových i pyrimidinových nukleotidů, stejně jako ApnA afinita k různým ligandům se liší např. P2Y1 receptor váže ATP a ADP, ale ne UTP nebo UDP naopak, P2Y2 receptor je aktivován ATP i UTP se stejnou potencí oba P2Y1 i P2Y2 receptory byly detekovány v mozku Nomenklatura P2Y receptorů je poněkud zmatečná, protože některé subtypy, u kterých se mělo za to, že jsou naklonovány, naklonovány vlastně nebyly :) P2Y receptory Všimněte si, že P2Y3, P2Y5, P2Y7, P2Y8 a P2Y9 , receptory vlastně nejsou ;)

34. Ionotropní purinergní receptory (P2X R) • P2X receptorů bylo charakterizováno 7 subtypů u člověka se nacházejí zejména na chromosomoech 12 a 17kationtové kanály aktivované ATP nebo ApnA sestávají z více podjednotek dva transmembránové segmenty s C- i N- koncem v cytoplasmě (podobně jako mechanosensitivní kanály vláskových buněk nebo epitheliální Na+ kanály obratlovců) nejspíše trimery, TM2 segment tvoří vnitřní pór in vitro formují homomery s výjimkou P2X6 podjednotky fuknční kanál obvykle heteroromer  extracelulární smyčky spojené disulfidickými můstky Na+, K+, Ca2+ • evolučně primitivní a nezávisle oddělená receptorová rodina

35. aktivace P2X receptorů  rychlé toky Na+, K+ a Ca2+ depolarizace buňky vyskytují se na periferii, na nervosvalovém spojení, v míše i mnoha oblastech mozku ovlivňují srdeční rytmus, cévní a svalový tonus, kontrakci vas deferens při ejakulaci nebo nocicepci overexprese P2X4 Rs v míše vede k hypersensitizaci citlivé na makrocyklický lakton ivermectin (zvyšuje jejich vodivost a zvyšuje pravděpodobnost otevření kanálu) P2X4 R

36. Funkce purinů  připisovaná celá řada funkcí, ale jen některé byly s určitostí potvrzeny adenosin má anxiolytické a hypnotické vlastnosti, což potvrdilo i podávání antagonistů adenosinových receptorů kofein a jiné methylxanthinové sloučeniny zvyšují bdělost a kognici antagonisté purinergních receptorů by mohli být využívání jako podpůrná léčba symptomů u deficitů spojených a Alzheimerovou chorobou a jinými formami demence Neuroprotekční účinky adenosinu: např. po mozkové mrtvici.  mrtvici doprovází ischemie spojená se zvýšením koncentrace glutamátu ten navozuje masivní vtok Ca2+ do buněk a jejich excitotoxickou smrt ideální neuroprotektivum: • za ischemických podmínek inhibuje presynaptický výlev glutamátu• zabraňuje depolarizaci postsynaptické membrány a vtoku Ca2+ do postsynaptické buňky adenosin vyhovuje oběma parametrům aktivace presynaptických A1 receptorů adenosinem blokuje výlev glutamátu aktivace postynaptických A1 receptorů otevírá draslíkové a chloridové kanály a vede k hyperpolarizaci membrány celkový výsledek: snížený vtok vápníku a nižší úmrtnost neuronů pokusy na zvířecích modelech tuto hypotézu potvrzují

37.  podání selektivníh agonistů A1 receptorů bezprostředně před ischemickou atakou nebo v jejím průběhuu  významné snížení ztráty neuronů a chrání před následnými deficity paměti naopak, podávání selektivních antagonistů ischemické poškození mozku zhoršuje • !POZOR! – množství adenosinu se v mozku během ischemie dramaticky zvyšuje aktivace A1 receptorů může být do určité míry neuroprotekční, na jiných subtypech purinergních receptorů vyvolává opačný efekt aktivace A2 receptorů na modely mozkové mrtvice  výrazně negativní dopad podávání selektivní antagonistů A2 receptorů působilo neuroprotekčně  stejně tak bezprostřední aktivace A3 receptorů výrazně zvyšovala u pokusných zvířat poškození mozku a úmrtnost kupodivu, dlouhodobé podávání téhož farmaka mělo efekt naprosto opačný na různorodosti těchto pozorování se zřejmě podílí vliv adenosinu na cévní tonus a agregaci krevních destiček Adenosinová signalizace v léčbě Parkinsonovy nemoci? •  ve striatu poměrně hojně exprimovány A2A receptory inhibují odpovědi navozené D2 receptory a naopak antagonisté je mimikují – aktivace A2A receptorů navozuje pokles motorické aktivity inverzní působení A2A a D2 receptorů by snad mohlo být užitečné v pomocné terapii alespoň těchto projevů popsáno několik látek, které při perorálním podání selektivně blokují A2A receptory při současném podávání s L-dopa snižují její vedlejší účinky u některých parkinsonických pacientů může zmírňovat dyskinesii i theofylin theofylin

38. Role purinů v modulaci imunitní odpovědi • cestou aktivace P2X7 receptorůdochází k poklesu intracelulární hladiny draslíku a formování tzv. inflamosomu • autokrinní purinergní signalizace = důležitý kontrolní bod při aktivaci leukocytů • puriny mohou (v závislosti na cytokinovém okolí) fungovat imunosupresivně i imunostimulačně Roli hraje také koncentrace ATP: mM koncentrace aktivují A2A a A2B receptory, což vede k inhibici výlevu granulí z neutrofilů a zabraňuje oxidativnímu vzplanutí X nM koncentrace ATP naopak stimulují A1 receptory, což vede k chemotaxi neutrofilů do místa zánětlivého stimulu.

39. Role purinův CNS • adenosin a ATP slouží také jako mediátor v komunikaci neuron-glie • oba indukují proliferaci astrocytů • v mikrogliích jsou exprimovány P2X i P2Y receptory • P2Y6 receptor, zprostředkovávající primárně odezvu na UDP, hraje důležitou roli ve fagoptóze mikroglií a jejich proliferaci • P2XR receptory jsou zapojeny do drah neuropatické bolesti • P2Y12 receptor = specializovaný pattern recognition receptor (receptor rozpoznávající vzorec/motiv), např. molekulární vzorec patogenity v rámci imunitní odpovědi • ve frontální kůře mozku pacientů s Alzheimerocou chorobou byla prokázána zvýšená hladina A1 a A2A receptorů, zatímco hladina A1 receptorů ve vnější vrstvě gyrus dentatus hippokampu byla snížena Kredit: http://journal.frontiersin.org/Journal/10.3389/fncel.2013.00049/full

40. Kredit: J Neurochem. 2014 Mar;128(5):650-61

41. Role purinův antikoalulaci • agonisté zejména P2Y12 receptoru • Prasugrel, Ticagrelor nebo Ticlopidin • Clopidogrel (prodáván jako Plavix = dříve celosvětově druhýnejpředepisovanější přípravek • musí být v organismu aktivován CYP2C19 v játrech • 2-14% US populace má sníženou hladinu tohoto jaterního enzymunižší účinnost a vedlejší účinky • Prasugrel tímto netrpí Clopidogrel Prasugrel

42. Co si pamatovat z dnešní přednášky • neuropeptidy: klasifikace • neuropeptidy: vznik a a proteolytické štěpení • neuropeptidy: rozdíly v signalizaci oproti „klasice“ • neuropeptidy: funkce • puriny: skladování a výlev • puriny: receptorové třídy • puriny: příklad farmakologie receptorů