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1975 - Stanley Cohen

1975 - Stanley Cohen. Plasmídeo. Conferencia de Asilomar - 1975 Pacific Grove - California USA. - 139 cientistas de 17 nações - Recombinant DNA Advisory Commitee - RAC. Normas para contenção biológica - P1  P4. H. Smith. D. Nathans. W. Alber. ENZIMAS DE RESTRIÇÃO.

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Presentation Transcript

  1. 1975 - Stanley Cohen Plasmídeo

  2. Conferencia de Asilomar - 1975 Pacific Grove - California USA - 139 cientistas de 17 nações - Recombinant DNA Advisory Commitee - RAC Normas para contenção biológica - P1  P4

  3. H. Smith D. Nathans W. Alber ENZIMAS DE RESTRIÇÃO

  4. Ferramentas de trabalho Enzimas de restrição Sistema restrição/modificação Tipo II - utilizadas na TDR: reconhecem seqüências específicas de nucleotídeos no DNA - palíndromos, atuam como verdadeiras tesouras moleculares Tipos de cortes: Produção de terminais coesivos (adesivos, protuberantes) Produção de terminais abruptos (ou cegos)

  5. b) Clivagem simétricamente situada ao redor do eixo de simetria a) Clivagem no eixo de simetria ...TC GA... ...GAA TTC... ...AG CT... ...CTT AAG... 3 ’ 5 ’ + 3 ’ 5 ’ 3 ’ 5 ’ + 5 ’ 3 ’ Moléculas com extremidades abruptas Moléculas com extremidades coesivas

  6. ENZIMAS DE RESTRIÇÃO

  7. Enzima de restrição EcoRI

  8. A tecnologia do DNA recombinante

  9. Ligação DNA plasmidial - vetor Extremidades coesivas Fragmento de DNA - inserto LIGASE

  10. Construção do DNA Recombinante Molécula de DNA de um plasmídeo linear com extremidades coesivas Molécula de DNA de um plasmídeo circular anelamento Clivagem com enzima de restrição Ligação covalente pela DNA ligase Inserção em uma célula hospedeira Molécula de DNA plasmidial contendo o inserto

  11. Vetores Hospedeiros Utilização clonagem Plasmídeos Bactérias / leveduras Cosmídeos Bacteriófagos Células eucarióticas Terapia gênica Virus

  12. Tipos de Vetores Plasmídeos: são usados para clonar fragmentos de DNA de vários pares de bases a centenas de pares de bases. Bacteriófagos: são usados para clonar fragmentos de DNA de 10.000 - 20.000 pares de bases. Cosmídeos: são estruturas híbridas que possuem características do bacteriófago associadas à do plasmídeo pBR322, e são utilizadas para a clonagem dos maiores segmentos de DNA. Chromosomos artificiais para bactérias (BAC) e leveduras (YACs): podem ser usados para clonagem de fragmentos de DNA com centenas a milhões de pares de bases.

  13. PlasmídeopBR 322

  14. PlasmídeopUC 18

  15. Bacteriófago

  16. Plasmídeopara leveduras

  17. Cosmídeos para leveduras

  18. Cromossomo artificial para bactéria

  19. Cromossomo artificial para leveduras

  20. A tecnologia do DNA recombinante

  21. Cortar o DNA com enzimas de restrição Fragmento 1 Fragmento 3 Fragmento 2 Fragmento 4 Inserir fragmentos em vetores Introduzir vetores em bactérias por: eletroporação ou choque térmico

  22. Eletroporação Transformação bacteriana

  23. Plaqueamento

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