SDS-PAGE Sodium Dodecyl Sulphate - PolyAcrylamide Gel Electrophoresis

1. Vježba 10, 11 i 12. Elektroforeza proteina, Westernblot (WB), imunofluorescencija (IF), imunohistokemija (ICH)

2. SDS-PAGESodiumDodecylSulphate-PolyAcrylamide Gel Electrophoresis Merkaptoetanol - denaturira protein, kida disulfidne veze sviproteiniimaju isti omjer naboja i mase aminokiselina:SDS = 2:1 Manji proteini brže putuju kroz gel katoda uzorak Proteinski marker Smjesa makromolekula gel anoda pufer

3. Vizualizacija proteina u gelu • BSA • 20 µg 10 µg5 µg2 µg Protein marker • Coomassie brilliant blue • Bojanje srebrom

4. Transfer proteina na membranu • Nitrocelulozna membrana • PVDF (polivinilidendifluorid) membrana

5. WESTERN BLOT Imunodetekcija PonceauS PonceauS reverzibilno BOJANJE membrane BLOKIRANJE membrane u puferu sa 5%BSA (Bovine serum albumin) Inkubacija s PRIMARNIM ANTITIJELOM preko noći ISPIRANJE membrane u TBS Tween-20 puferu (TrisBufferedSaline) Inkubacija s SEKUNDARNIM ANTITIJELOM ISPIRANJE membrane u TBS Tween-20 puferu Inkubacija s ILUMINOGENIMsupstratom za peroksidazu hrena (HRP) VIZUALIZACIJA (svjetlosni signal na fotopapiru)

6. IMUNOKEMIJSKE METODE • temelje se na specifičnoj reakciji antigen-protutijelo i stvaranju kompleksa Ag-Ab PRIMJENA IMUNOKEMIJSKIH METODA • detekcija proteina nakon elektroforezeu gelovima i na membranama nakon prijenosa (Western blotting) • detekcija antigena na prerezima tkiva (mikroskopija) • detekcija antigena na stanicama (protočna citometrija) • kvantitativno određivanje antigena u otopinama (RIA, EIA, ELISA)

7. PROTUTIJELA (antitijela) su glikoproteini(imunoglobulini) sintetizirani kao odgovor organizma na prisustvo stranih tvari, antigena. Luče ih plazma stanice koje poticu od B limfocita. • osnovna jedinica imunoglobulina je sastavljena od 4 lanca, dva duža (teški lanci) i dva kraca (laki lanci). • At i Ab vežu se slično kao enzim i supstrat stvaranjem slabih veza. • Aminokiseline koje tvore aktivno mjesto nalazi se na varijabilnim dijelovima lakih i teških lanaca. • EPITOP – dio antigena koji prepoznaje imunološki sustav • Priprema antitijela za westernblotting • primarna antitijela • POLIKLONSKA antitijela - antitijela se proizvode imunizacijom životinje (obično kunića ili miša) sa pročišćenim proteinom od interesa, te se izoliraju iz seruma životinje • MONOKLONSKA antitijela - hibridomi • Sekundarna antitijela - u većoj životinji (kozi, ovci ili svinji) komercijalno se proizvode obilježena antitijela koja specifično reagiraju s antitijelima kunića ili miša (npr. kozja antikunićja antitijela)

8. PROIZVODNJA MONOKLONALNIH ANTITIJELA http://www.sumanasinc.com/webcontent/animations/content/monoclonalantibodies.html

9. PROIZVODNJA POLIKLONALNIH ANTITIJELA

10. OBILJEŽAVANJE PROTUTIJELA • Fluorogeni spojevi, fluorofori (fluorescein, rodamin, fikoeritrin) • Radioaktivni izotopi, radionuklidi (jod125, H3) • Enzimi: peroksidaza iz hrena (HRP), alkalna fosfataza • DETEKCIJA • Fluorescencija (produkt koji fluorescira) • Kolorimetrija (obojen i netopiv produkt – denzitometrija, obojen produkt mjerljiv u vodi – fotometrija) • Luminiscencija (fotoni svjetlosti, bioluminiscencija, kemiluminiscencija) • Bioluminescencija: oksidacija luceferinapomoculuciferaze, enzima iz krijesnica, uz utrošak ATP • Kemiluminiscencija: Oksidacijom luminola, uz prisutnosti vodikovog peroksida, nastaje 3-aminoftalat, koji je ekscitiran i prelaskom u niže energetsko stanje emitira fotone svjetlosti koji se detektiraju pomoću fotografskog filma.

11. SDS PAGEhttp://www.youtube.com/watch?v=toPpdoBYPWo Westernblot:http://www.youtube.com/watch?v=pRIn3p7x3V8 Imunofluorescencija: http://www.youtube.com/watch?v=pteO6FRWo3g Imunohistokemija: http://www.youtube.com/watch?v=HdBgTAAi3rU