Embriologia eksperymentalna ssaków Opracowała: Małgorzata Wierzbicka

1. Produkt protoonkogenu c-mos częściowo degradowany po uwolnieniu z bloku metafazy drugiego podziału mejotycznego i utrzymywany podczas interfazy w zygocie myszy Embriologia eksperymentalna ssaków Opracowała: Małgorzata Wierzbicka

2. Wstęp

3. Badania na płazach • W niezapłodnionych komórkach jajowych kregowców, cykl komórkowy jest zatrzymany w metafazie drugiego podziału mejotycznego (metafaza II) przez czynnik cytostatyczny CSF • W metafazie II, kiedy CSF jest aktywny, aktywność MPF jest wysoka i pozostaje nienaruszona • Oocyt zostaje uwolniony z bloku metafazowego po zapłodnieniu lub aktywacji • Produkt protoonkogenu c-mos jest zaangażowany w aktywność CSF • Bialko Mos jest obecne w dużych ilościach w oocycie w metafazie II i nie zostało wykryte w zapłodnionych komórkach • Białko Mos może być degradowane po zapłodnieniu lub aktywacji przez proteazę kalpainową zależną od wapnia

4. Badania na myszach • Działanie CSF nie zostało dowiedzione • Wykazano, że blok metafazowy zależy od syntezy pewnych białek • Zarówno c-mos mRNA jak i jego produkt (białko p39mos) są obecne w oocycie od wczesnych stadiów pęcherzyka zarodkowego do stadium metafazy II, kiedy to następuje zatrzymanie cyklu komórkowego • Wstrzyknięcie do oocytu w stadium pęcherzyka zarodkowego c-mos-specyficznych antysensownych oligonukleotydów zapobiega wyrzuceniu I ciałka kierunkowego i przejściu do metafazy drugiego podziału mejotycznego

5. Materiały i metody • 5-6 tygodniowym samicom myszy podano 5 IU oraz (48h później) hCG • Owulowane oocyty uzyskano 14 i 16 h po podaniu hCG przez nakłuwanie ampuli jajowodów w roztworze hialuronidazy • Oocyty zaktywowano 18 h po podaniu hCG przez 6,5 min.ekspozycję w 8% alkoholu • Komórki hodowano w pożywce M2 pod parafiną w 37 0C • Zapłodnione komórki jajowe uzyskano przez połączenie samic z samcami i wyizolowanie z jajowodów 25-27h po podaniu hCG Do obserwacji wczesnych etapów (wyrzucenie ciałka kierunkowego, formowanie przedjądrza) wybrano, ze względu na lepszą synchronizację, jaja aktywowane w alkoholu

6. Materiały i metody c.d • Badano aktywność kinazy histonu H1(cdc2) (badanie aktywnosci MPF) w HK buforze przy użyciu egzogennych histonów H1. Odpowiednio przygotowane próbki poddano eloktroforezie na 15% żelu poliakrylamidowym • Zaktywowane oocyty po wyrzuceniu ciałek kierunkowych poddano immunoprecypitacji używając przeciwciał skierowanych przeciwko cyklinie B. Próbki badano na 10% żelu poliakrylamidowym • W celu stwierdzenia obecności produktu genu c- mos zastosowano immunoblotting

7. Wyniki

8. Aktywność kinazy histonu H1(cdc2) 1-oocyty w bloku metafazy II 2-oocyty zaraz po wyrzuceniu II ciałka kierunkowego 3-oocyty 5-7 h po aktywacji (G1) 4-oocyty 13-15 h po zapłodnieniu (S)

9. Wniosek aktywność MPF (wyrażona aktywnością kinazy cdc2) spada gwałtownie po wyrzuceniu II ciałka kierunkowego

10. Degradacja cykliny B w momencie wyrzucenia II ciałka kierunkowego 1-oocyty kontrolne 2-komórki tuż po wyrzuceniu II ciałka kierunkowego

11. Wniosek Ponad 65% cykliny B jest degradowane w momencie wyrzucenia II ciałka kierunkowego

12. Eksperyment (immunoblot ) pokazujący obecność białka Mos w oocytach • Rysunek lewy 1- 1500 oocytów w metafazie II: 2- 1500 oocytów we wczesnej interfazie (zaraz po wyrzuceniu II ciałka kierunkowego): 3- 1500 oocytów w póżnej fazie G1: 4- 1500 oocytów w fazie S • Rysunek prawy 125, 250, 500 ,750 oocytów w metafazie II

13. Spostrzeżenia • Ilość Mos po wyrzuceniu II ciałka kierunkowego jest podobna do ilości obserwowanej w metafazie II (87%) • Ilość Mos w fazie G1 i w późnej fazie S znacznie się zmniejszyła (pozostało jedynie 23% białka obecnego w metafazie II)

14. Wniosek • Białko Mos nie jest w znaczący sposób degradowane w momencie wyrzucenia II ciałka kierunkowego => • jest degradowane później, podczas fazy G1 • Około 23% białka Mos nie jest degradowane i jest obecne podczas 1 cyklu mitotycznego w zygocie

15. Podsumowanie

16. U płazów, produkt protoonkogenu c-mos jest kluczowym katalitycznym komponentem CSF; celem kinazy Mos może być cyklina B, regulatorowa podjednostka MPF • U myszy białko Mos jest syntetyzowane w dojrzewających oocytach, ale nie w zygocie; c-mos RNA jest degradowane podczas dojrzewania mejotycznego • U obu gatunków, podczas zapłodnienia, CSF powinien być inaktywowany, żeby umożliwić dalszy rozwój => Nie ma jednak bezpośrednich dowodów, że CSF jest inaktywowany podczas wyjścia z bloku metafazy II

17. Istnieją dwie możliwości: 1.inaktywacja CSF jest konieczna do wyjścia z II podziału mejotycznego 2.aktywacja powoduje zniszczenie cykliny w sposób, który nie może być zablokowany przez aktywny CSF W 2. Przypadku destrukcja CSF ma miejsce póżniej, podczas pierwszego cyklu, i ten przypadek, jak wynika z badań, dotyczy myszy

18. Mos jest kluczowym, katalitycznym składnikiem czynnika cytostatycznego (CSF) => Istnieją dwie potencjalne możliwości inaktywacji CSF: 1.zmiana aktywności białka Mos 2.degradacja Mos przez proteazę kalpainową zależną od wapnia W 2.przypadku aktywacja proteazy mogłaby zachodzić w momencie napływu wapnia, który ma miejsce zaraz po zapłodnieniu.

19. Degradacja produktu c-mos ma miejsce po degradacji cykliny B i inaktywacji MPF. • Jeśli inaktywacja CSF ma związek z destrukcją białka Mos oznacza to, że inaktywacja CSF nie jest konieczna do wyjścia z bloku metafazowego. Degradacja Mos podczas fazy G1 1.cyklu komórkowego zygoty może być konieczna, aby uniknąć bloku metafazowego podczas mitotycznych podziałów • Jeśli inaktywacja CSF jest wymagana do wyjścia z bloku metafazy II, to nie ma ona związku z degradacją Mos, tylko raczej z mechanizmem regulacyjnym, który modyfikuje aktywność CSF (np. przez zmianę stanu fosforylacji Mos) • 23% białka Mos obecnego w metafazie II jest w zygocie jeszcze w późnej fazie S (częściowo mogą to być nowo zsyntetyzowne białka, ponieważ pewne ilości c-mos mRNA są obecne na tym etapie) • Niewielkie ilości Mos obecnego w zygocie mogą odgrywać rolę podczas przejścia z fazy G2 do M

20. Koniec