Cellules souches

1. 50 * * * * * * * * * * * * * * * control * control Mo Xseb4R Mo 40 1799 cells 40 925 cells 476 cells Xseb4R 30 30 XHes2-∆WRPW (dominant négatif) 1630 cells % of retinal cells % of retinal cells * 20 20 XHes2-∆WRPW-VP16 (antimorphe) * * 10 10 0 0 Ganglion cells Amacrine cells Bipolar cells Horizontal cells Müller cells Photoreceptors cells Müller cells Ganglion cells Amacrine cells Bipolar cells Horizontal cells Photoreceptor cells Epithélium pigmenté Cellules souches Rétine neurale Neuroblastes Précurseurs en différenciation Cristallin ZMC Cascade de signalisation Notch/Delta: Étude d’un nouveau gène de la famille hairy/enhancer of split, Xhes2 Nerf optique ZMC = zone marginale ciliaire DNA + GFP DNA + Dotap Crible par hybridation in situ chez tropicalis A B xrp1 elrB elrC elrD etr-1 Xrp1 hermes A B nrp1 D C RNA binding proteins GCL elrB elrC elrD 1 Xseb4R Xseb4R F etr-1 xrp1 E C D 2 nrp1 IINL RRM 1 3 4 H nrp-1 xrp1 G Xseb4R OINL E F Musashi etr-1 nrp1 RRM 1 RRM 2 PRL RPE H G etr-1 nrp1 elrB, C, D etr-1 Elav/Hu Bruno Xseb4R elrC elrB, C, D xrp1 Nrp-1 Xseb4R Etr-1 nrp1 RRM 1 RRM 2 RRM 3 nrp1 Post-mitotic cells Dividing cells INDUCED AT ST 10,5 - 11 Control Mo Xseb4R Mo + DEX Ntubulin expression - DEX Candidats potentiels déjà disponibles Rétinogenèse chez le xénope: des cellules souches aux neurones différenciés M. Amato; S. Boy; A. della Puppa; Y. Aoki; N. Grandchamp; M. Segalen; J. Hamdache et M. Perron Laboratoire Gènes, Développment et Neurogenèse, UMR CNRS 8080 Bât. 445 Université Paris XI, 91405 ORSAY PUBLICATIONS • Amato, M.A., K. Koebernick, T. Pieler, W.A. Harris and and Perron, M. Hedgehog signaling controls the maintenance of stem cell/progenitor proliferation in Xenopus retina. Soumis. • Amato, M.A., Boy, S., Arnault, E., A, Girard, M., Sharif, A., Dellapuppa, A. and Perron, M. (2005). Comparison of the expression patterns of five neural RNA binding proteins in the Xenopus retina. J. Comp. Neurol. 481(4):331-9. • Agnès, F. and Perron, M. (2004). RNA binding proteins and neural development: a matter of targets and complexes. NeuroReport . 15(17):2567-70. • Amato M.A., Arnault E. and Perron M. (2004) . Retinal stem cells in vertebrates: parallels and divergences. Int. J. Dev. Biol. "Eye development" special issue 48: 993-100. • Boy S., Souopgui J., Amato M.A., Wegnez M., Pieler T. and Perron M. (2004) XSEB4R, a novel RNA-binding protein involved in retinal cell differentiation downstream of bHLH proneural genes. Development 131: 851-62. • Amato M.A., Boy S. and Perron M. (2004) Hedgehog signalling in vertebrate retinal development: a growing puzzle. Cell Mol Life Sci 61:899-910. • Perron M, Boy S, Amato MA, Viczian A, Koebernick K, Pieler T, Harris WA. (2003). A novel function for Hedgehog signalling in retinal pigment epithelium differentiation. Development 130:1565-77. • Ohnuma S, Mann F, Boy S, Perron M, Harris WA. (2002). Lipofection strategy for the study of Xenopus retinal development. Methods 28:411-9. Détermination des cellules rétiniennes Etude du transcriptomedes cellules souches rétiniennes collaboration avec E. Bellefroid (Belgique); K. Koebernick; M. Solter; Jacob Souopgui et Tomas Pieler (Allemagne) OBJECTIF Dans le but de mieux comprendre les cascades géniques impliquées dans le choix de la destinée de ces précurseurs rétiniens, nous avons étudié les rôles joués par les cascades de signalisation Hedgehog et Notch/Delta, ainsi que le rôle joué par des facteurs post-transcriptionnels. collaboration avec Nicolas Pollet; Raphaël Thuret; Qods Ymlahi Ouazzani et André Mazabraud Les précurseurs rétiniens sont à l’origine de la rétine neurale et de l’épithélium pigmenté rétinien. La rétine neurale contient six types de neurones (cônes, bâtonnets, amacrine, bipolaire, horizontale et ganglionnaires) et un type de cellules gliales (Müller). Chez les amphibiens, la rétine croît pendant toute la vie de l’animal par addition de nouvelles cellules de tous types au niveau de la zone marginale ciliaire. La ZMC est la région annulaire située aux extrémités de la rétine, composée de cellules souches, de rétinoblastes et de précurseurs neuraux en différenciation. La ZMC est non seulement accessible pour des analyses expérimentales pendant toute la vie de l’animal, mais a aussi l’avantage exceptionnel de présenter des cellules ordonnées spatialement selon le développement et la différenciation cellulaire. Jusqu’en 2000, les cellules souches de la rétine avaient été identifiées uniquement dans la ZMC des poissons et des amphibiens. Cependant, il a récemment été montré que l’épithélium pigmenté du corps ciliaire de la rétine des mammifères adultes contient des cellules souches rétiniennes. LES CONSTRUCTIONS HES2 Technique de lipofection in vivo XHes2 Groucho WRPW helix loop helix basique orange HC • OBJECTIF • Etant données les applications potentielles des cellules souches rétiniennes dans des interventions thérapeutiques de dystrophies rétiniennes, il est important de caractériser davantage ces cellules souches rétiniennes au niveau moléculaire. • Notre projet constiste donc à: • rechercher par hybridation in situ des gènes exprimés dans les cellules souches de la ZMC de la rétine de xénope • étudier le rôle de ces gènes dans la maintenance et le potentiel de différenciation de ces cellules souches rétiniennes • Intérêts du xénope: • Approche in vivo • Approche à grande échelle Expression du gène Xhes2 très régionalisée, dans les vésicules optiques et otiques Expression du gène Xhes2 dans la zone marginale ciliaire de la rétine domaine d’activation de VP16 SPECIFICATION NEURONALE 80 Témoin 70 * % de cellules * ∆WRPW 60 * 80 * XHES2 * VP16 * 60 Témoin 1244 cellules 11 rétines 40 Témoin XHes2 * * 40 * * * 30 4 * GLIOGENESE NEUROGENESE ∆WRW * * * * * * * XHes2 939 cellules 13 rétines * * * * * 20 20 * 2 * * * * * VP16 10 * 0 * Müller Types cellulaires: Cellules de Muller bipolaire amacrine 0 horizontale ganglionnaire photorecepteur Müller bipolaire amacrine horizontale ganglionnaire photorecepteur L’inhibition de Xhes2 diminue la gliogenèse La surexpression de Xhes2 favorise la gliogenèse L’inhibition de Xhes2 affecte la distribution des différents types de neurones • Banque de rétine et de cerveaux de bourgeons caudaux de Xenopus tropicalis • Séquençage (Génoscope) de 30 000 clones • Assemblage des séquences (N. Pollet; R. Thuret): 5-6000 gènes • Préparation des sondes et crible in situ « RNA binding proteins » La distribution des “RNA binding proteins” dans la rétine suggère que, comme les facteurs de transcription, ces régulateurs post-transcriptionnels jouent des rôles importants à toutes les étapes de la rétinogenèse et dans tous les neurones rétiniens. Transcription des sondes DIG anti-sens Amplification par PCR des clones d’une plaque 96 puits Hybridation in situ sur embryons entiers de Xenopus tropicalis et coupes au vibratome des embryons présentant une expression dans l’œil Expression du gène Xseb4R dans la zone marginale ciliaire de la rétine Xseb4R aurait aussi un rôle “proneural” au cours de la neurogenèse primaire • Musashi: nrp1, xrp1: voir partie “RNA binding proteins” Xseb4R est le premier facteur post-transcriptionnel, positionné dans la cascade de neurogenèse, à avoir un rôle dans la détermination des neurones rétiniens • Cascade Hedgehog: voir poster Hedgehog, Amato et al. La surexpression de Xseb4R dans la rétine a un effet proneural, sa perte de fonction a l’effet opposé