PAPEL DE LA CITOGENÉTICA EN EL DIAGNÓSTICO HEMATOLÓGICO

1. PAPEL DE LA CITOGENÉTICA EN EL DIAGNÓSTICO HEMATOLÓGICO Ricardo Molina Gasset Marzo 2011

4. El análisis citogenético convencional consiste: • Estudio de las alteraciones cromosómicas en las metafases de las células neoplásicas obtenidas tras: • El cultivo "in vitro", 37ºC durante 24/72h • Con o sin mitógenos , dependiendo de la muestra • Agente antimitótico(colchicina), detención división celular enmetafase • Choque hipotónico, rotura membrana celular, fijación de núcleos • Teñidos fundamentalmente con bandas G (Tripsina-Giemsa) • Permite detectar en un único experimento: • + alteraciones numéricas (monosomías, trisomías, etc.), • + alteraciones estructurales (translocaciones, inversiones, deleciones, etc.)

5. DIFERENTES TIPOS DE TINCIÓN DE CROMOSOMAS

9. HIBRIDACIÓN IN SITU (CISH, FISH) Utilidad: *Detectar y localizar secuencias específicas de ADN o ARN Uso: *Preparaciones cromosómicas *Extensiones celulares *Cortes de tejido *Cortes ultrafinos (Microscopia electronica) CITOGENÉTICA MOLECULAR

12. Sondas centroméricas están formadas por una secuencia repetitiva de ADN que hibrida con el ADN de la región centromérica del cromosoma. Éstas permiten detectar alteraciones cromosómicas numéricas (monosomías o trisomías) • Sondas de pintado cromosómico están formadas por una batería de sondas que en su conjunto hibridan con todo el cromosoma. Dichas sondas permiten visualizar alteraciones citogenéticas numéricas y estructurales. • Las sondas de secuencia única o locus especifico hibridan con el ADN de una región genómica concreta, correspondiente a un gen o a una banda cromosómica. Con ellas es posible detectar alteraciones numéricas y estructurales

14. Las técnicas M-FISH o SKY se basan en la cohibridación de 24 sondas de pintado cromosómico marcadas con fluorescencia sobre metafases. • El resultado de la hibridación permite visualizar simultáneamente cada par cromosómico de un color diferente. • Determina de forma inequívoca cariotipos complejos y cromosomas no identificables con las técnicas de bandeo. • Limitación en aquellas patologías con un índice proliferativo bajo debido a la necesidad de obtener células en división. • No permiten el reconocimiento de algunos puntos de rotura como aquellos asociados con deleciones, inserciones, adiciones y translocaciones de pequeño tamaño (inferiores a 10 Mb

15. Tecnica: Marcar el ADN de cada cromosoma con uno o varios fluorocromos, de manera que el espectro de emisión de cada cromosoma sea único y diferenciable de los demás. Esta técnica, por tanto, pinta a cada cromosoma de un color. Con el "cocktail" de 24 sondas de pintado cromosómico obtenido tras el marcaje, se hibrida sobre los cromosomas de las metafases del tumor, el cromosoma anómalo aparecerá no uniforme, sino con los colores de los cromosomas que intervienen en la translocación. Por tanto, es una forma de realizar un cariotipo, pero teñido no con bandas G sino con colores, de forma que podamos clasificar las alteraciones de forma unívoca. El cariotipo multicolor se ha mostrado muy útil en neoplasias hematológicas, donde no es difícil obtener metafases tumorales.

21. En los últimos años se ha descrito la técnica de multibanding-FISH o “cross species color banding (RxFISH), técnica similar a las de M-FISH o SKY, que permite la generación de un patrón de bandas de distintos colores para cada par de cromosomas homologos. Su principal ventaja es que permite detectar inversiones y traslocaciones entre cromosomas homólogos, sin embargo, su principal limitación es que un mismo color puede estar en regiones de distintos cromosomas y esto dificulta poder conocer la región cromosómica que está implicada.

24. La hibridación genómica comparada (HGC), también llamada CGH (del inglés, comparative genomic hybridization), es una técnica citogenética molecular que permite detectar cambios numéricos de secuencias de ADN (pérdidas, deleciones, ganancias y amplificaciones) en un tejido de la muestra a estudiar (tumor o sangre del paciente). Dicha técnica se basa en la hibridación del ADN tumoral y de un ADN control marcados con fluorocromos de distinto color sobre metafases normales. La HGC tiene particular interés en el análisis de cambios numéricos de secuencias de ADN en tumores sólidos y en neoplasias hematológicas de índice proliferativo bajo ya que para la realización de la técnica no es necesaria la obtención de metafases. Así mismo, es de gran utilidad en aquellos casos que presentan cariotipos complejos con numerosos cromosomas marcadores, dobles diminutos (DM) y regiones de tinción homogénea (HSR). Esta técnica únicamente detecta cambios presentes en una proporción elevada de células tumorales (50%) y tiene una resolución de 10 Mb. Por otra parte, no permite detectar translocaciones, inversiones y otras alteraciones de tipo equilibrado que no comportan ganancias o pérdidas de material genético.

28. VENTAJAS E INCONVENIENTES

30. Con el mismo fundamento que la HGC, recientemente ha surgido la técnica denominada array-CGH o matrix CGH, que en lugar de hibridar sobre portaobjetos con metafases, hibrida sobre matrices con BACs u oligos que pueden cubrir todo el genóma, permitiendo detectar cambios genéticos de 0.5 a 1 Mb. Parece que el futuro de la citogenética pasa por la realización del cariotipo y del chip para la realización de la CGH array. Esta metodología, tiene una serie de limitaciones que deben tenerse en cuenta, entre las que cabe destacar: • - precio elevado del chip de CGH array (500-1000 euros/muestra) • - análisis de un gran número de datos • - existencia de polimorfismos en el genóma humano que se pueden dar lugar a ganacias o pérdidas de regiones del genóma y que es importante conocer su valor diagnóstico • - no detecta cambios equilibrados • - si la población alterada está poco representada (menos del 50%), la CGH array no puede detectar los cambios cromosómicos. • Es por ello, que el futuro, seguira contando con la realización del cariotipo en en algunos casos deberá complentarse, según la orientación diagnóstica, con los estudios de CGH array.