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新生儿干血斑 G6PD 筛查检测及其室间质量保证

新生儿干血斑 G6PD 筛查检测及其室间质量保证. 江剑辉 广州市新生儿筛查中心. 一、干血斑荧光斑点测定法. 1．原理. 正常人： 葡萄糖-6-磷酸在葡萄糖-6-磷酸脱氢酶（ G6PD） 的催化下生成6-磷酸葡萄糖酸（6 PG）， 并产生还原型辅酶Ⅱ（ NADPH）, 此产物在特定波长紫外线光照射下可发荧光。 G6PD 缺陷： 因 NADPH 生成减少，则荧光减弱或不产生荧光。

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新生儿干血斑 G6PD 筛查检测及其室间质量保证

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Presentation Transcript

  1. 新生儿干血斑G6PD筛查检测及其室间质量保证 江剑辉 广州市新生儿筛查中心

  2. 一、干血斑荧光斑点测定法

  3. 1．原理 • 正常人：葡萄糖-6-磷酸在葡萄糖-6-磷酸脱氢酶（G6PD）的催化下生成6-磷酸葡萄糖酸（6PG），并产生还原型辅酶Ⅱ（NADPH）,此产物在特定波长紫外线光照射下可发荧光。 • G6PD缺陷：因NADPH生成减少，则荧光减弱或不产生荧光。 • 氧化型谷胱甘肽（GSSG ）的应用：NADPH又参与红细胞氧化型谷胱甘肽（GSSG）转变为还原型谷胱甘肽（GSH）的反应，在反应液中加入GSSG，使NADPH被消耗并氧化成无荧光的氧化型辅酶Ⅱ(NADP)，使杂合子容易检出。

  4. GSH GSSG NADP NADPH（荧光） G6PD­ 葡萄糖 →葡萄糖-6-磷酸 6-磷酸葡萄糖酸 （G6P） （6PG） ↓ 磷酸戊糖 红细胞G6PD代谢示意图 NADP 氧化型辅酶Ⅱ GSSG 氧化型谷胱甘肽 NADPH 还原型辅酶Ⅱ GSH 还原型谷胱甘肽

  5. 2.仪器和材料 • 1）仪器 • ①ZF-1型（激发光波长254nm和 365nm）紫外线分析仪(上海顾村电光仪器厂)。 • ②水浴箱或电热烘箱。 • ③新华定性滤纸。 • ④3mm打孔器(钳)。 • 2)标本：血纸片在室温下自然晾干，避免日照，尽快检测（或置4℃冰箱内1周内检测）。 • 4）试剂

  6. 3.实验操作步骤 • 用打孔器取直径3mm的血斑纸片于试管或酶标板中 • 加入反应混合液100ul • 孵化：置37℃温箱中或电热烘箱30分钟， • 用吸管取少量浸出液于滤纸上，立即用风筒（低挡凉风）吹干 • 将滤纸置紫外灯下观察荧光反应。

  7. 4.结果判断 • (1)正常：孵化10分钟后出现荧光。 • (2)轻度缺陷：孵化20分钟有荧光。 • (3)中度缺陷：孵化30分钟有荧光。 • (4)重度缺陷：孵化30分钟仍无荧光。 • 荧光斑点试验的特异性高，对男性半合子和女性纯合子的检出率高达100％。对G6PD活性正常者与直接测定法（分光光度法）符合率为98.8％。

  8. 方法学特点 • 荧光斑点试验的特异性高，对男性半合子和女性纯合子的检出率高达100％。 • 对G6PD活性正常者与直接测定法（分光光度法）符合率为98.8％。

  9. 5.注意事项 • (1) 孵化前检查试管内纸片是否在反应液内。 • (2) 滴浸出液前摇动试管，以混匀浸出液。 • (3)每次滴后迅速吹干滤纸后才观察荧光，因斑点湿润时荧光会减弱。

  10. 二、用荧光定量法测定干血斑G6PD活性

  11. 1.原理： • 正常机体G6PD催化二磷酸己糖旁路反应的第一步为：G6P底物在G6PD催化下转变成6PG，同时伴随发生NADP减少，NADPH（可发荧光）增加。 • 筛查血斑标本与底物试剂G6P和NADP在室温下混合30分钟可发生上述反应 • 加入铜溶液使反应终止，用荧光仪在波长355nm激发光和波长460nm发射光下测定反应物荧光。 • 通过标准曲线得出未知样本和质控品中G6PD浓度(U/gHb), G6PD低于切值者为G6PD缺乏。

  12. 2.材料与方法 • (1) 标本来源: 新生儿筛查滤纸干血斑标本，采血滤纸为筛查专用S＆S903滤纸。 • (2) 试剂及仪器: • 试剂盒 • 荧光读数测定仪。

  13. (3)操作步骤 • 打孔 • ↓ • 加G6PD酶反应混合液（100ul/孔） • ↓ • 恒温25℃、振速1150 r/min 振荡30分钟, • ↓ • 去纸片 • ↓ • 加200ul/孔铜试剂 • ↓ • 激发波355nm和发射波460nm荧光读数 。

  14. 3．结果判断 (1)参考切值：G6PD = 2.0 IU/gHb (2) G6PD ≥2.0 IU/gHb 判断为G6PD正常 G6PD <2.0 IU/gHb 判断为G6PD缺乏阳 性 (3)每个实验室应根据本筛查网络的标本条件和本地G6PD缺乏发病率设定切值.

  15. 比色定量法（四唑氮蓝法）简介 • 打纸片 • 加200L 缓冲液，在室温(18-37oC)下摇晃孵育20分钟。 • 孵育20分钟 • 加100ul的稀释液 • 在550 或570 nm 下读取读数（初始读数）。 • 在室温(18-37oC)下孵育孔板10分钟，此步不要摇晃。 • 在550 或570 nm 下读取读数（终末读数）

  16. 4.注意事项 • (1)G6PD反应混合液配制后要待充分反应15分钟才能使用 • (2)已配制的G6PD反应混合液保质期限为7天，应在保质期限内使用否则会对实验造成影响 • (3)荧光测定时间延长可能会影响测定荧光值，建议在加入终止液后15~30分钟内完成荧光检测 （4）纸片降低测定的荧光值

  17. 参加G6PD检测室间质量保证计划 • 台北阳明大学提供 • 质控品：10份/次，6~10次/年 • 质控品送出后一周内完成结果上报 • 质控结果

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