Přednášky z lékařské biofyziky Masarykova univerzita v Brně - Biofyzikální centrum

1. Přednášky z lékařské biofyzikyMasarykova univerzita v Brně - Biofyzikální centrum Úvod do molekulární biofyziky II

2. Struktura biopolymerů • Studium struktury biopolymerů a jejich komplexů např. umožňuje pochopit: • Specificitu enzymatických a imunologických reakcí • Účinky některých léčiv (cytostatik) na molekulární úrovni. • Mechanismy transportních procesů • Buněčný pohyb • ……………..

3. Metody založené na měření mechanických vlastností • Velikost a tvar makromolekul lze studovat měřením: • osmotického tlaku • difuzního koeficientu • viskozity (tvaru molekul) • Zjištění poloměru částic: • Měření rychlosti sedimentace • Zjištění velikosti a částečně i tvaru: • TEM • chromatografie - molekulově-síťový efekt (gelová permeační chromatografie) • elektroforetická pohyblivost bílkovin (dodecylsulfát sodný se definovaně váže k bílkovině a eliminuje její vlastní elektrický náboj, přičemž nese jeden náboj záporný).

4. B) Metody založené na měření interakce s elektromagnetickým zářením • Absorpční spektrofotometrie. • VIS • IR • UV Speciální metody • Ramanova spektrometrie.

5. Zařízení založená na interakci elektromagnetického záření s makromolekulami

6. Druhy spektrofotometrů • Spektrofotometry jsou laboratorní přístroje používané pro měření koncentrace látek absorbujících nebo emitujících infračervené, viditelné nebo ultrafialové světlo. Mohou být též použity pro studium jejich chemické struktury. • Absorpční spektrofotometry: založeny na spektrální závislosti absorpce světla. • Emisní spektrofotometry: Zdrojem světla je sama analyzovaná látka, jež je injektována nebo rozprašována do bezbarvého plamene. Emitované světlo prochází optickým hranolem nebo mřížkou, takže můžeme získat celé emisní spektrum. Frekvence přítomné ve spektru umožňují identifikovat např. přítomné ionty. • Spektrofluorimetry: emise světla je vyvolána světlem o vlnové délce kratší než je vlnová délka světla emitovaného.

7. Absorpční spektrofotometry: Lambertův-Beerův zákon Absorpční spektrofotometrie je založena na absorpci světla při průchodu vrstvou roztoku. Jeho koncentrace může být zjištěna pomocí Lambertova-Beerova zákona: I = I0.10-ecx c je koncentrace rozpuštěné látky, x tloušťka vrstvy, I0 původní intenzita světla, I je intenzita světla po průchodu vrstvou. Konstanta e (epsilon, absorpční nebo extinkční koeficient) závisí na vlnové délce světla, na rozpuštěné látce a rozpouštědle. Její hodnoty pro běžné chemické sloučeniny lze nalézt v tabulkách. Tyto hodnoty jsou vždy udávány pro určitou vlnovou délku (obvykle absorpční maximum). Číselné hodnoty tohoto koeficientu závisejí na tom, jak je vyjadřována koncentrace rozpuštěné látky. Když použijeme mol.l-1, hovoříme o molárním absorpčním koeficientu.

8. Poměr intenzit světla prošlého a dopadajícího se nazývá transmitance (dříve transparence). Dekadický logaritmus převrácené hodnoty transmitance se nazývá absorbance A. S ohledem na L.-B. zákon je tedy absorbance přímo úměrná koncentraci rozpuštěné látky a tloušťce absorbující vrstvy roztoku. A = e.c.x

9. Druhy absorpčních spektrofotometrů • Podle konstrukce rozdělujeme spektrofotometry na jednopaprskové a dvoupaprskové. • U jednopaprskových spektrofotometrů jeden svazek světla prochází nejdříve srovnávacím a pak měřeným vzorkem (kyvety obsahující roztoky musí být pohyblivé). U dvoupaprskových spektrofotometrů jeden svazek světla prochází měřeným vzorkem a druhý srovnávacím vzorkem (blankem). Dvoupaprskové přístroje umožňují podstatně rychlejší měření, avšak jsou dražší. U jednoduchých přístrojů je nastavování vlnové délky světla ruční. U pokročilejších přístrojů se toto nastavování děje automaticky, což umožňuje přímo získávat absorpční křivky, tj. grafy závislostí absorbance na vlnové délce světla.

10. Jednopaprskový spektrofotometr Zdrojem světla (1) je žárovka s wolframovým vláknem. Její polychromatické světlo prochází kondenzorem (2) a odráží se od zrcadla (3) na vstupní štěrbinu (4) monochromátoru (části 4 až 8, plus 12). Světlo je soustřeďováno čočkou (5) na odrazovou optickou mřížku (6), která tvoří barevné spektrum. Téměř monochromatické světlo je promítáno objektivem (7) na výstupní štěrbinu (8) monochromátoru.

11. S mřížkou lze otáčet pomocí ovladače vlnových délek (12), čímž se zaměřuje světlo o určité vlnové délce na výstupní štěrbinu. Svazek světla pak prochází kyvetou (9) se vzorkem. Intenzita prošlého světla je měřena fotodetektorem (10, 11). Jeho signál je zesilován zesilovačem (13). Hodnota absorbance je zobrazena na displeji (14). Intenzita světla prošlého srovnávacím roztokem je vždy srovnávána s intenzitou téhož svazku světla prošlého měřeným vzorkem.

12. NIR = near infrared = blízká infračervená oblast Moderní UV/VIS/NIR spektrofotometr Světlojedné vybrané vlnové délkynebocelé prošlé spektrummůže být měřeno

13. Další optické metody • Absorpční spektrofotometrie v UV oblasti. • Tryptofan a tyrosin mají absorpční maximum kolem 280 nm. Fenylalanin při 255 nm. • Nukleotidy (dusíkaté báze) - absorpční maxima při 260 - 270 nm. • Chromofory - jejichabsorpční vlastnosti se mění v závislosti na chemickém okolí.

14. Absorpční spektra aminokyselin Podle: http://www.gwdg.de/~pdittri/bilder/absorption.jpg

15. Tryptofan je přirozeným chromoforem – obr. ukazuje zhášení jeho fluorescence v závislosti na koncentraci 9-cis-retinalu. Jde o vliv této látky na bílkovinu potřebnou k regeneraci rodopsinu.http://www.molvis.org/molvis/v4/a33/nickerson-fig2.html

16. Hypochromní efekt (HE). • Absorpce světla ovlivňována dipólovým momentem vazeb, se kterými interaguje. Jsou-li dipóly paralelní, vzájemně se ovlivňují a snižuje se poněkud jejich schopnost absorbovat energii fotonů. U bílkovin se HE projevuje u peptidových vazeb, které mají absorpční maximum v UV kolem 190 nm. Jsou-li dipólové momenty těchto vazeb náhodně uspořádané (denaturovaná bílkovina), absorbují světlo lépe než ve stavu s pravidelnými strukturami. • Helicita - poměrné zastoupení uspořádaných částí makromolekuly. Dvoušroubovice DNA absorbuje UV méně než neuspořádaná (denaturovaná) molekula.

17. Hypochromní efekt u kyseliny polyglutamové. Při pH 7 vytváří statistické klubko (1), při pH 4 má šroubovicovou strukturu (2). Absorpční maximum peptidových vazeb je pak sníženo vlivem jejich prostorového uspořádání. e je molární absorpční koeficient a l je vlnová délka UV záření. Dle Kalouse a Pavlíčka, (1980).

18. Optická rotační disperze • Měření optické aktivityi absorpce polarizovaného světla. Při konformačních změnách molekul se mění stavba molekul, což lze polarimetricky sledovat • Přesnější: Optická rotační disperze (ORD) - závislost optické otáčivosti na vlnové délce světla. Lze získat údaje o zastoupení a-šroubovic či poměrném zastoupení a-šroubovic a b-struktur. • Nakonec byla tato metoda nahrazena citlivější metodou cirkulárního dichroismu (CD)

19. Cirkulární dichroismus Obdobné informace: metoda cirkulárního dichroismu (CD) - porovnávána absorbance levotočivě a pravotočivě cirkulárně polarizovaného světla v oblasti absorpčního maxima Podobné využití mají tyto metody i při studiu struktury NK. Obrázek ukazuje změny elipticity syntetického polypeptidu s dlouhými úseky poly-glu po různém přídavku trifluoroetanolu (TFE), který zvyšuje zastoupení a-helixu. http://www-structure.llnl.gov/cd/polyq.htm

20. Ramanova spektrometrie Rayleighův rozptyl světla. Nastává interakcí fotonů s molekulami, jež se projeví jen velmi malou nebo žádnou změnou vlnové délky. Intenzita rozptýleného světla závisí na molekulové hmotnosti a také na úhlu rozptylu, což lze využít pro odhad tvaru makromolekul. Při rozptylu světla dochází k malé změně vlnové délky rozptýleného světla, způsobené malým pohlcením či zvýšením energie rozptylovaných fotonů při přechodech mezi vibračními a rotačními stavy molekul. Ty se mění při změnách struktury molekul - změny Ramanových spekter proto odrážejí změny struktury molekul.

21. Ramanova spektrometrie Ramanovo spektrum polytenního chromosomu rodu Chironomus. Při vybraných vlnočtech lze s výhodou realizovat Ramanovu mikroskopii. Vybuzeno laserovým světlem o vlnové délce 647.1 nm Podle: http://www.ijvs.com/volume2/edition3/section4.htm

22. Mikroskopický snímek v normálním bílém světle • (chromosom Chironomus Thummi Thummi) Konfokální ramanovský snímek zobrazující páteř DNA (vibrace při 1094 cm-1 • Konfokální ramanovský snímek zobrazující přítomnost alifatických řetězců v bílkovinách chromosomu při 1449 cm-1 • Zdroj jako předchozí

23. IR spektrofotometrie • Infračervené záření (IR) působí na rotační a vibrační stavy molekul. Složité molekuly mohou vibrovat nebo rotovat mnoha různými způsoby (módy).Různé chemické skupiny (-CH3, -OH, -COOH, -NH2atd.) mají specifické vibrační a rotační frekvence, a proto absorbují IR světlo o specifických vlnových délkách. • Z tohoto důvodu mají infračervená absorpční spektra mnoho maxim. Změna chemické struktury se projevuje jako změna polohy těchto maxim ve spektru.

24. Infračervené vibrační spektrum hexanuhttp://www.columbia.edu/cu/chemistry/edison/IRTutor.html

25. Informace o sekundární a terciární struktuře bílkovin či NK poskytují i: • metody elektrochemické(studuje se interakce makromolekul s elektrodami) • nukleární magnetická resonance(umožňuje určit chemické okolí studovaných atomů), • elektronová spinová resonance aj.

26. Rentgenstrukturní analýza • Krystalová mřížka působí na rtg záření jako optická mřížka. Dochází k ohybovým jevům a vzniku interferenčních obrazců. Tyto obrazce lze matematicky analyzovat a získat tak informaci o rozložení elektronů v molekulách tvořících krystal. http://cwx.prenhall.com/horton/medialib/media_portfolio/text_images/FG04_02aC.JPG

27. Mapa elektronové hustoty získaná z rentgenového krystalogramu

28. Krystalogram B-DNA získaný v r. 1952 Rosalindou E. Franklinovou, na základě kterého předložili Watson a Crick model dvoušroubovicové struktury DNA F C W

29. Nové mikroskopické techniky • optická skanovací mikroskopie v blízkém poli(near-field optical scanning microscopy, NFOS - Near-field Scanning Optical Microscopy, NSOM, SNOM) Schéma optického skanovacího mikroskopu pro pozorování v blízkém poli. Otvorem v kovovém obalu skleněného hrotu, který má průměr 5 - 10 nm, prochází úzký paprsek světla argonového laseru. Preparát (tenký řez) se pohybuje nad otvorem. Kontrola vzdálenosti preparátu pomocí tunelového efektu. Zpracováno podle Rontó a Tarjána (1994).

30. Plasmidová DNA – 10kb • http://www.snom.omicron.de/examples/twinsnom/x-tsnom_12.html Hrot propouštějící světlo pozorovaný v normálním optickém mikroskopu • http://physics.nist.gov/Divisions/Div844/facilities/nsom/nsom.html

31. Nové mikroskopické techniky AFM – Atomic force microscopy – jemný hrot sleduje nerovnosti povrchu http://physchem.ox.ac.uk/~rgc/research/afm/afm1.htm

32. Nové mikroskopické techniky AFM – Atomic force microscopy Plazmidová DNA – 10 kb, • http://www.snom.omicron.de/examples/twinsnom/x-tsnom_12.html Krystalická struktura křemíku – atomové rozlišení • http://www.omicron-instruments.com/ products/afm_stm/r_afmst6.html

33. DNA zobrazená pomocí AFM -http://spm.phy.bris.ac.uk/research/DNA/images/dna2.jpg

34. Nové mikroskopické techniky • skanovací tunelová elektronová mikroskopie(scanning tunnelling electron microscopy, STM). Zjednodušené schéma elektronového skanovacího tunelového mikroskopu (STM). Nahoře celkové schéma přístroje, dole detail snímací kovové jehly, která svým pohybem kopíruje povrch vzorku. Jehla je nabita kladně. Zpracováno podle Rontó a Tarjána (1994).

35. Nové mikroskopické techniky skanovací tunelová elektronová mikroskopie - STM. Nápis IBM vytvořený z atomů xenonu na niklové podložce http://www.almaden.ibm.com/vis/stm/images/stm10.jpg Rozštěpené a nerozštěpené kruhy plasmidové DNA • http://www.sci.port.ac.uk/spm/overfig5.htm

36. Problém • Nelze obecně předpokládat, že struktura bílkoviny v krystalickém stavu, v roztoku a in situ je identická. Bílkoviny jsou někdy aktivní jen jako integrální součásti jiných struktur. Struktura NK bude ovlivňována interakcí s bílkovinami. Lokální změnu struktury DNA vyvolávají i látky, které se mohou vmezeřit (interkalovat) mezi paralelně uspořádané báze v dvoušroubovici.

37. Metody separace koloidů a hrubých disperzí Pomíjíme chromatografii a chemické metody. Dva cíle: • Separacedisperzního prostředí a disperzního podílu. • Rozdělení (frakcionace)polydisperzních systémů na složky. • Příklad: analýza krevní plazmy, mozkomíšního moku aj. a) Ultrafiltrace. • Membrána propouští jen rozpouštědlo a malé molekuly. Na koloid je nutno působit zvýšeným tlakem, který překonává jeho onkotický tlak a urychluje přestup rozpouštědla na druhou stranu membrány - velmi šetrná metoda. • Chceme-li z koloidu odstranit pouze nízkomolekulární příměsi, ne však rozpouštědlo, lze použít dialýzu. • Dialyzační princip se uplatňuje i v umělé ledvině.

38. Metody separace koloidů a hrubých disperzí • b) Sedimentace • K jejímu urychlení se používají centrifugy (ultracentrifugy, až několika set tisíc ot./min, až miliony g). • Sedimentační rychlost závisí na rozdílu hustot částic a prostředí, na jejich velikosti a tvaru. Hlavně se uplatňují tři síly: • 1) Vztlakovádle Archimedova zákona: F = (r - r').V.a = (r - r').V.r.w2 kde ra r' jsou hustoty částic a rozpouštědla, V objem částice, a odstředivé zrychlení, r poloměr otáčení, wúhlová rychlost.

39. 2) Odstředivá: F = mef.r.w2 kde mef je tzv. efektivní hmotnost: mef = V(r - r') • 3) Odporu proti pohybu tělesa v kapalině (Stokesův vzorec) F = 6.p.r.h.v kde r je poloměr částice, hdynamická viskozita, v rychlost pohybu částice vůči kapalině.

40. Sedimentaci částic charakterizujeme pomocí sedimentačního koeficientu s [s]: Okamžitá rychlost je derivací dráhy podle času, v = dr/dt (částice se pohybuje ve směru r, takže po vynásobení čitatele i jmenovatele ve vzorci výrazem w-2 napíšeme:

41. Po separaci proměnných a integraci získáváme rovnici: ln r = s.w2.t + konst. s je obsaženo ve směrnici závislosti přirozeného logaritmu r na čase. Tento graf lze získat proměřováním polohy částice r během sedimentace. • Sedimentační koeficient menších molekul bílkovin - 10-13 s. • Jednotka sedimentačního koeficientu: svedbergS ( = 1.10-13 s). • Zviditelnění sedimentujících látek: měřením absorpce UV záření nebo indexu lomu.

42. Sedimentační koeficient s závisí na molekulové hmotnosti M dle Svedbergova vzorce: kder je hustota prostředí, rb hustota molekul, NA Avogadrova konstanta a f tzv. frikční neboli hydrodynamický koeficient. Hustota makromolekul se měří pyknometricky, hydrodynamický koeficient měřením difuze.

43. Sedimentační analýza • K rozdělení polydisperzního koloidu dochází vlivem různě rychlého odstředivého pohybu jednotlivých složek (frakcí). Dvě možnosti: • 1) Analyzovaným koloidem se převrství čisté rozpouštědlo. Po určité době odstřeďování se zjišťuje poloha jednotlivých složek koloidu v rozpouštědle - zónová sedimentace. • 2) Sedimentace v hustotním gradientu - v kyvetě se intenzívním odstřeďováním připraví hustotní gradient vhodné látky (např. CsCl). Pohyb sedimentující složky se zastaví tam, kde vztlaková síla bude stejná jako síla odstředivá. • Důkaz tzv. semikonzervativního modelu replikace DNA.

44. Analytická ultra-centrifugaschéma podle:http://www.embl-heidelberg.de/ExternalInfo/geerlof/draft_frames/flowchart/Characterization/AUC/auc.html#Why Analytical Ultracentrifugation

45. Měření membránových potenciálů • Membránové potenciály se měří s pomocí skleněných mikroelektrod, tj. skleněných kapilár s velmi jemnou úzkou špičkou. Průměr otvoru na konci špičky musí být menší než 1 mm, aby nedošlo při zavádění do buňky k jejímu významnému poškození. Vnitřní prostor špičky kapiláry je naplněn roztokem KCl o koncentraci 3 mol.l-1. Jako elektroda srovnávací se používá elektroda stříbrochloridová umístěná do mimobuněčného prostoru. • Pro skleněné mikroelektrody je charakteristický vysoký vnitřní odpor (kolem 10 MW), takže potřebujeme pro měření vysoce kvalitní zesilovače, abychom zamezili zkreslení měřeného napětí.

46. Experimentální uspořádání pro měření membránových potenciálů kapilárními mikroelektrodami Pomocí skleněných mikroelektrod lze také měřit jiné elektrochemické parametry buněk a membrán, např. koncentraci některých iontů. Mohou být připraveny jako elektrody iontově selektivní pro Na+, K+, Ca2+, H+ …

47. Metoda patch-clamp („terčíkový zámek“) Tupá skleněná mikroelektroda se přiloží k povrchu buňky nebo k části biologické či umělé membrány.Otvor na konci mikroelektrody je zcela uzavřen „terčíkem“ membrány a měřená elektrická napětí nebo proudy se proto týkají jen malého okrsku membrány, v němž se nalézá jen malý počet iontových kanálů. Některé iontové kanály mohou být předem uzavřeny nebo otevřeny, náplň mikroelektrody může obsahovat ligandy, schopné interagovat s iontovými kanály, a všeobecně jakékoliv látky, jež mohou ovlivňovat funkci membrány.Tato metoda umožňuje studium aktivity jednotlivých iontových kanálů nebo jejich malých skupin.