Le cytosquelette

1. Le cytosquelette I - Les principes communs aux trois types de filaments, assemblage, désassemblage II - Régulation des filaments du cytosquelette III - Les moteurs moléculaires IV - Fonctions du cytosquelette dans la cellule

2. II - Régulation des filaments du cytosquelette

3. Dynamisme des éléments du cytosquelette • Régulation des filaments en longueur, stabilité, nombre et géométrie • Interagissent les uns avec les autres et avec les autres composants de la cellule • Parfois liaisons covalentes de protéines accessoires • Soit avec les sous-unités • Soit avec le filament

4. Plan • Nucléation • Protéines de liaison  dynamisme du cytosquelette • Organisation d'ordre supérieur • Fixation des éléments du cytosquelette à la membrane plasmique

5. A – Nucléation • Nucléation des microtubules • -tubuline • Centrosome • Autres cas • Nucléation des microfilaments

6. 1 - Nucléation des microtubules • Centre Organisateur des MicroTubules (COMT) = site de nucléation des microtubules dans la cellule • -tubuline = nucléation des microtubules • De la levure à l'homme • Présente dans tous les COMT • -tubuline ring complex (-TuRC) = COMT très puissant

7. a) - Nucléation des microtubules par la -tubuline • Nucléation à l’extrémité moins • Allongement par l’extrémité plus • Intervention de deux protéines qui se fixent directement à la -tubuline

8. Fig16-22 Nucléation d'un microtubule par -TuRC Présence des deux protéines plus des protéines accessoires pour aider à la création de l’anneau -tubuline ring complexes en microscopie électronique MT nucléés à partir de -tubuline ring complexes purifiés

9. Moritz,M2001(fig1) Modèles de nucléation des microtubules Microtubule nucléé spontanément à partir de tubuline / pure Modèle avec matrice Modèle protofilament

10. Moritz,M2001(fig2) • Structure de -tubuline ring complexes isolés de drosophile Dgrip Drosophila gamma ring protein

11. Moritz,M2001(fig4) New models of microtubule nucleation by the -TuRC or monomeric -tubulin TuSC : -tubulin small complex Dgrip : Drosophila gamma ring protein

12. b) - Le centrosome : principal centre organisateur des microtubules Situé près du noyau Émanation des microtubules en étoile à partir du centrosome Extrémité - des MT dans le centrosome Extrémité + des MT en périphérie Contient plus de 50 copies de -TuRC dans sa matrice Contient une paire de centrioles

13. Fig16-23 Le centrosome

14. Les centrioles • id corpuscules basaux des cils et des flagelles • Matériel péricentriolaire = matrice centrosomale • Duplication des centrioles suivie de la duplication des centrosomes • cf. mitose

15. Structure des centrioles • Cylindre de microtubules + protéines accessoires

16. Fig16-24 Un centriole dans un centrosome Matrice centrosomale fibreuse

17. c) - Cas particuliers de COMT Champignons et diatomés pas de centriole plaques incluses dans l'enveloppe nucléaire : corps du pôle du fuseau Plantes supérieures pas de centriole COMT répartis tout autour de l'enveloppe nucléaire Présence de -tubuline dans tous les cas

18. Orientation des microtubules • Configuration en étoile des microtubules • Extrémité plus tournée vers l’extérieur de la cellule • Extrémité moins tournée vers le noyau • Dispositif de surveillance • de la périphérie de l’intérieur de la cellule • et de la position centrale du centrosome • conservé même in vitro…

19. Fig16-25 Positionnement du centrosome au centre de la cellule Centrosome isolé + tubuline dans une chambre artificielle en plastique (image toutes les 3 minutes)

20. Holy,TE1997 Positionnement des COMTs dans des micro-chambres • Positioning of MTOCs in microfabricated chambers. (a) Three differential interference contrast images of a centrosome in a square chamber. The chamber is 4 μm deep and the tubulin concentration is 3.2 mg/ml. Images are 3 min apart. The slope of the well dominates the signal close to the edges of the chamber. (b) Three fluorescence images of an AMTOC in a square chamber. The chamber is 6 μm deep and the tubulin concentration is 1.4 mg/ml. Time is indicated in each frame. (c) An aster regrown from an AMTOC in 2.3 mg/ml tubulin, stabilized by diluting with 30% (vol/vol) glycerol/BRB80, spun down through a cushion of 40% glycerol/BRB80 onto a coverslip coated with 3-aminopropyltriethoxysilane, and fixed with glutaraldehyde. Image taken by confocal fluorescence microscopy. (d) Two centrosomes in a square chamber. (All bars are 10 μm.)

21. Fig16-26 Mélanophore de poisson

22. MT = point de repère dans la cellule • Permet de retrouver le centre de la cellule • Permet de disposer les organites dans les cytosol • Propriété intrinsèque des microtubules

23. 2 - Nucléation des microfilaments (d'actine) (Nucléation des MT : près du noyau) Nucléation des microfilaments : sur la membrane plasmique  accumulation de microfilaments en périphérie  définit le cortex cellulaire Cortex cellulaire Couche de filaments d’actine accumulés sous la membrane plasmique Détermine la forme et le mouvement de la surface cellulaire  forme 1-D : microvillosités, spicules, filopodes 2-D : lamellipodes

24. Anciens filaments existant avant la perméabilisation Fig16-27 Bord avant d’un fibroblaste : nucléation des MF Incubation avec actine-rhodamine visualisant les nouveaux filaments d’actine 5 m Nouveaux filaments formés sur le bord avant: site de nucléation des filaments

25. Symons,MH1991p503 • Control of actin polymerization in live and permeabilized fibroblasts • MH Symons and TJ Mitchison J. Cell Biol. 1991 114: 503-513 • Figure 2. Localization of rhodamine-actin incorporation in fibroblasts fixed shortly after injection. (a-c) shows a detail of a cell simultaneously permeabilized and fixed 24 s after injection. • (a) Rhodamine stain, showing newly incorporated actin. The arrows outline the section corresponding to the profiles in (d). • (b) Fluorescein- phalloidin stain, showing both preexisting and newly incorporated filaments; • (c) rhodamine/fluorescein ratio image, the arrowheads delineate the lamellipodium, and correspond to the fat arrows marked in the intensity profiles . The appearance of the stress fibers in the ratio image (c) as yellow over a red background, while they are not visible in the rhodamine image (a) itself, is caused by the higher background in the perinuclear part of the rhodamine image, which is divided by the stress fibers in the corresponding area of the fluorescein image (b) . • (d) Not shown Normalized intensity profiles from the respective channels along the lines delineated by arrows in a. ( - ) Fluorescein profile; ( - - - -) rhodamine profile. The fat arrows in ddelineate the lamellipodium, the thin arrow indicates the front of the wave of incorporated actin. See Materials and Methods for further details. The color scale from green to purple corresponds to low and high rhodamine/fluorescein ratios, respectively. • Bars, (b) 10 /,m; (d) 2 .5 Am. • Figure 4. Steady-state incorporationof injected actin, showing a detail of a cell fixed 20 min after injection. • (a) Rhodamine stain, showing the incorporated actin. The arrows outline the section corresponding to the profiles in d. • (b) Phalloidin stain . • (c) Rhodamine/ fluorescein ratio image, arrowheads delineate the lamellipodium boundaries . • (d) Not shown Normalized intensity profiles along the section marked in a. Full-line fluorescein profile and dashed line, rhodamine profile. Fat arrows delineate the lamellipodium. • Bars : (b) 10 um; (d) 2.5 gym. Contrôle de la polymérisation de l’actine dans des fibroblastes vivants et perméabilisés

26. Symons,MH1991p503 • Control of actin polymerization in live and permeabilized fibroblasts • MH Symons and TJ Mitchison J. Cell Biol. 1991 114: 503-513 • Figure 5.Rhodamine-actin incorporation in saponin-permeabilized cells. • (a) rhodamine stain, showing exogenous actin incorporation ; • (b) fluorescein-phalloidin stain, showing preexisting and newly incorporated filaments; • (c) rhodamine/fluorescein ratio, arrowheads outline the lamellipodial boundary • (d) not shown / intensity profiles along the arrows shown in a. For this experiment 0.4 t.M RA was added together with 0.2 mg/ml saponin in permeabilization buffer and incubated for 5 min before fixation. • Bars : (b) 10 I,m; (d) 2.5 um. Control de la polymérisation de l’actine dans des fibroblastes vivants et perméabilisés

27. Mécanisme de la nucléation • Régulée par des signaux externes • Catalysée par un complexe de protéines qui comprend deux Actine Related Proteins (ARPs)

28. Actin Related Proteins (ARPs) • Catalysent la nucléation de l'actine • 2 protéines proche à 45% de l'actine • Fonction analogue à -TuRC pour la tubuline • Comprend le complexe ARP (= Arp 2/3) • Nuclée le filament à partir de l’extrémité – • Et allonge rapidement l’extrémité + • Peut se fixer latéralement  embranchement

29. Fig16-28(AB) Rôle du complexe ARP dans la nucléation de l'actine

30. Fig16-28(C) Rôle du complexe ARP dans la formation du réseau d'actine

31. Microscopie électronique de complexes Arp2/3 en congélation sublimation et ombrage rotatoire (A) et de complexes mélangés avec des filaments d’actine cappés avec de la gelsoline (B-D). Mullins,RD1998 Electron micrographs of quick-frozen, deep-etched, and rotary-shadowed samples of Arp2/3 complex (A) and complex mixed with gelsolin-capped actin filaments (B-D). In the presence of Arp2/3, complex actin filaments form branching arbors with numerous end-to-side connections between filaments (B). The branch points appear to be rigid attachments with a fixed 70° angle between actin filaments (C) and frequently contain a globular mass at the point of attachment (C, left arrow in B). (D) Filaments partially decorated with Arp2/3 complex. (E) Globular masses associated with filament pointed ends in the presence of Arp2/3 complex. Conditions: buffer same as Fig. 1

32. Données évolutives -tubuline et ARP • Très anciens • Très conservés • Duplication du gène codant pour tubuline ou actine avec une fonction de nucléation en plus par divergence et spécialisation

33. B – Protéines de liaison  dynamisme du cytosquelette • Protéines de liaison aux sous-unités libres • Actine • Thymosine • Profiline • Tubuline • Stathmine • Protéines de liaison latérale • Tubuline • MAPs • Actine • Tropomyosine • Cofiline • Protéines de liaison aux extrémités • Actine • Tubuline

34. 1 - Protéines de liaison aux sous-unités libres • Actine • Tubuline

35. a) Actine • Dans une cellule (non musculaire) : 50% actine filamenteuse / 50% actine soluble • [Actine] en monomère dans une cellule : 50-200 M (2-8 mg/ml) • Cc [Actine] en monomère en tube à essai : <1 M  • Pourquoi l’actine soluble ne polymérise-t-elle pas en filaments dans la cellule ? • Parce qu’il y a des protéines qui empêchent la polymérisation en se fixant sur les sous-unités

36. Protéines de liaison aux sous-unités libres d’actine Thymosine : la plus abondante Profiline Ne peuvent être fixées en même temps

37. Thymosine • Bloque l'actine libre  • Qui ne peut s’associer ni au bout + ni au bout - • Bloque l'échange et/ou l'hydrolyse de ATP • Empêche l'allongement • Comment utiliser cette actine séquestrée ? • Système de régulation de la thymosine ? non • Intervention de la profiline ? oui

38. Profiline • Se fixe sur l'extrémité + du monomère à l’opposé de la gorge qui contient l’ATP (extrémité -) • Bloque ainsi le côté du monomère qui s’associerait normalement à l’extrémité – du filament • Le complexe actine-profiline peut facilement se fixer sur l’extrémité + libre d’un filament. • Dès que le complexe actine-profiline est additionné  changement de conformation de l’actine  diminution de l’affinité actine / profiline  profiline part  allongement facilité

39. Résumé thymosine-profiline • Thymosine • Bloque le monomère partout • Profiline • Allonge le filament à son bout + • « Déséquestre » l’actine de la thymosine

40. Fig16-29 Profiline liée à un monomère d'actine Fixée sur l'extrémité + à l’opposé de la gorge qui contient l’ATP Peut allonger l’extrémité + du filament Ne peut pas allonger l’extrémité – du filament – +

41. Compétition thymosine – profiline • Compétition pour se fixer au monomère d’actine • Activation locale de molécules de profiline  libération de l’actine séquestrée par la thymosine

42. Fig16-30(1) Résumé : Effets de la thymosine et de la profiline sur la polymérisation de l'actine

43. Fig16-30(2) Effets de la thymosine et de la profiline sur la polymérisation de l'actine

44. Régulation de l’activité de la profiline • Par phosphorylation • Par liaison aux phospholipides inositol (PI) • Protéines intra cellulaires avec domaines riches en proline

45. Sites de régulation de la profiline • Membrane plasmique • Se lie aux phospholipides de la membrane plasmique • En relation étroite avec l’extérieur pour faire croître lamellipodes ou filopodes

46. b) Tubuline • C de tubuline libre dans la cellule > Cc [tubuline] en monomère en tube à essais • Pourquoi la tubuline soluble ne polymérise-t-elle pas en microtubules dans la cellule ? • Parce qu’il y a des protéines qui séquestrent la tubuline libre

47. La stathmine • Se fixe sur deux hétérodimères de tubuline et empêche leur addition aux microtubules • Diminue ainsi la concentration de tubuline disponible pour la polymérisation (comme la colchicine)

48. La stathmine • Taux d’élongation d’un MT = Kon x [tubuline]  • Si [tubuline]   taux d’élongation  • Or la stathmine  [tubuline] en la séquestrant  • Stathmine  taux d’élongation du MT

49. La stathmine • Le passage de l’état de croissance au désassemblage du microtubule est une course entre l’hydrolyse du GTP et l’allongement du filament  • Comme la stathmine  [tubuline] en la séquestrant • Stathmine  le désassemblage du microtubule

50. Fig16-31 Effets de la stathmine (=oncoprotéine 18) sur la polymérisation des microtubules