Les examens biologiques en Hématologie

1. Les examens biologiquesen Hématologie Rémi Letestu Laboratoire d’Hématologie CHU Avicenne UFR SMBH DCEM1 (2006-07)

2. Hématopoïèse Cellules souches Progéniteurs lymphoïdes CFU-GEMM MOELLE OSSEUSE BFU-E CFU-E Tpo réticulocytes mégacaryocytes SANG plaquettes monocytes éosinophiles T B érythrocytes neutrophiles basophiles lymphocytes macrophages

3. Les différents examens MOELLE OSSEUSE Myélogramme Biopsie médullaire SANG NFS ou hémogramme Frottis sanguin GANGLION (adénopathie) Ponction gg Biopsie gg BIOPSIES Chirurgicales ou à l’aiguille

4. Les différentes techniques CYTOMETRIE EN FLUX ou IMMUNOPHENOTYPAGE CYTOLOGIE Cytochimie CYTOGENETIQUE HISTOLOGIE ou ANATOMO-PATHOLOGIE BIOLOGIE MOLECULAIRE

5. Hémogramme ou NFS • Définition: analyse quantitative et qualitative des éléments figurés du sang • Décompte des GR, GB, et plaquettes par unité de vol de sang (numération) • Décompte des ≠ sous-types de GB (formule sanguine) • Analyse morphologique de ces éléments

6. La Numération Formule Sanguine (NFS) • Ponction de sang veineux • Prélèvement sur anticoagulant : EDTA • Compteurs Automatiques : • importance des contrôles ++

7. Valeurs Normales de l ’Hémogramme La Numération • Globules Blancs : 4-10x109/L 4-15x109/L • Plaquettes : 150-450 x109/L 20 x109/L • Globules Rouges • H : 4.5-6.2 x1012/L F : 4-5.4 x1012/L • E : 3.6-5 x1012/L NRS : 5-6 x1012/L • Hémoglobine (Hb) • H : 13-18 g/dL F : 12-16 g/dL • E : 12-16 g/dL NRS : 14-20 g/dL • Hématocrite • H : 40-54% F : 35-47% • E : 36-44% NRS : 44-62%

8. Valeurs Normales de l ’Hémogramme • Les Réticulocytes • Automates / Coloration sur lame (/1000 GR) • Environ 1-/120° des GR • Expression en valeur absolue • 25000 à 100000 quand Hb Normale • La Formule • Polynucléaires Neutrophiles : 1.7-7x109/L • Polynucléaires Eosinophiles : 0-0.5x109/L • Polynucléaires Basophiles : 0-0.05x109/L • Lymphocytes : 1.5-4x109/L • Monocytes : 0.1-1x109/L

9. Valeurs Normales de l ’Hémogramme Les constantes de Wintrobe • Volume Globulaire Moyen (VGM) 85-95 fl (83-97) • Concentration Corpusculaire Moyenne en Hb (CCMH) 32-36% • Teneur Corpusculaire Moyenne en Hb (TCMH) 27-32 pg/cellule

10. Frottis sanguin • Technique • Étalement d’une goutte de sang sur une lame • Coloration May-Grünwald-Giemsa (MGG) • Analyse au microscope • Indications • Diagnostic d’anomalies morphologiques • Des GR • Des GB • Des plaquettes • Recherche et identification de cellules anormales • myélémie, • blastes • cellules lymphomateuses • Vérification du nombre de plaquettes++

11. Quand prescrire un Hémogrammeen urgence • Etat de choc • Pâleur intense, asthénie, • Angine ulcéro-nécrotique ou résistante aux antibiotiques • Fièvre élevée après prise de médicament, surtout après chimiothérapie anti-mitotique • Fièvre résistante aux antibiotiques • Purpura pétéchial, syndrome hémorragique

12. Valeurs de l’hémogramme indiquant une consultation spécialisée en urgence • Hématocrite supérieur à 60 % • Anémie inférieure à 7 g/dl ou mal tolérée • Neutropénie inférieure à 200/mm3 (0.2 G/L) • Hyperleucocytose faite de cellules immatures supérieure à 20 000/mm3 • Thrombopénie inférieure à 20 000/mm3 (20 G/L) même sans syndrome hémorragique • Après élimination d’une fausse thrombopénie à l’EDTA

13. Le Myélogramme • Historique • 1920-1927 Arinkin -1935 Mallarmé • Ponction Sternale / Iliaque Post > Antérieure • Indications • Nombreuses : toute suspicion d’anomalie centrale de production des éléments du sang Anémies normo ou macrocytaires arégénératives et/ou Neutropénies et/ou Thrombopénie Pancytopénie Pic monoclonal • Diagnostic • Analyses spécialisées • Contre-indications • Très rares - Enfant - Contre indication sternale • Troubles graves de la coagulation

14. Le Myélogramme • Précautions • Indispensables • Chez l ’enfant • Formation au geste • Règles strictes • Déroulement du geste • Anesthésie locale • Ponction • Réalisation des frottis : point essentiel Trocart de type Mallarmé Trocarts de type Jamshidi

15. Le Myélogramme • Quantité & Qualité de la Moelle Osseuse • Cellules à l ’origine des éléments circulants • Exploration des lignées Myéloïde et Lymphoïde

16. La lignée granuleuse neutrophile MB Myéloblaste PML Promyélocyte MLN Myélocyte neutrophile MMLN Métamyélocyte PN Polynucléaire neutrophile

17. PROER Proérythroblaste La lignée érythroblastique ERB Érythroblaste basophile ERP Érythroblaste polychromatophile ERA Érythroblaste acidophile

18. L ’Adénogramme • Organe lymphoïde • Exploration des lignées Lymphoïdes • Ponction aiguille • Frottis Facile, non douloureux, informatif ++

19. Les Biopsies • Chirurgicales • Masse tumorale (lymphomes) • Ganglion : La biopsie ganglionnaire • A l’aiguille • Sous Scanner • La Biopsie Ostéo-Médullaire (BOM)

20. La biopsie ganglionnaire • Prélèvement ganglion entier par technique chirurgicale • Morphologie, coupes histologique • Immunomarquages sur lame • immunocytochimie • Suspension de cellules

21. La biopsie ostéomédullaire (BOM) • Historique • 1920-1927 Arinkin • 1950 développement • Ponction Iliaque Post • Indications • Nombreuses • Diagnostic et Bilan d ’extension • Analyses spécialisées • Contre-indications • Rares • Troubles graves de la coagulation • Thrombopénie sévère, thrombopathie • Déroulement du geste

22. La Cytométrie enFlux Système Fluidique • Mélange cellulaire hétérogène et complexe • Injection de la suspension cellulaire • Liquide de gaine sous pression • Etirement de la veine liquide • Alignement et passage des cellules une par une dans la chambre d ’analyse Paramètres Optiques • Dans la chambre d’analyse : impact avec un faisceau LASER • Lumière monochromatique cohérente • «Eclairage de la cellules» • Taille relative : Forward Scatter ou FSC • Complexité cytoplasmique : Side Scatter SSC • Excitation des fluorochromes et émission de fluorescence

23. Paramètres fluorescents Pourquoi la cellule est-elle fluorescente ? • Les cellules expriment des marqueurs antigéniques : • Protéines • Sucres • En surface ou en intracytoplasmique • Marqueurs classés en CD (Cluster de Differenciation) • Sélection d’anticorps reconnaissant spécifiquement ces marqueurs • Couplage des anticorps à différents fluorochromes • Signaux fluorescents recueillis : • Nombre et type de marqueurs exprimés Qualitatif • Densité d’expression Quantitatif

24. Conversion en données numériques • Recueil des signaux optiques : • Miroirs, filtres, photomultiplicateur • Transformation en signaux électroniques pour une analyse informatique avec un logiciel dédié • Mise en forme des données • Analyse des graphes, positionnement des seuils de positivité et des populations d’intérêt, statistiques

25. Applications dans un Laboratoire de Recherche • Etudes de la fonction Immune • Cellules Hématopoïétiques • Etudes Multi-drug résistance (cancer) • Etudes cinétiques (fonction cellulaire) • Analyse des plaquettes • Détection des Microorganismes (Bactéries, Parasites) • Analyse des échantillons de l’environnement (Giardia, Cryptospiridium) • Détection Micro-Particules & Virus

26. Applications en Biologie Médicale • Immunophénotypage Leucémie et Lymphomes • Suivi de la maladie résiduelle des hémopathies • Immunophénotypage VIH • Comptes Absolus CD4 • Numération cellules progéniteurs (CD34) • Analyse des glycoprotéines plaquettaires • Cycle cellulaire et ploïdie de tumeurs • Numération des Réticulocytes • Cross-Match (transplantation d’organe) • Détection des Leucocytes Résiduels

27. Cytogénétique CaryotypeCultureMitosesClassement des chromosomes FISH Hybridation in situ de sondes fluorescentes

28. X2 X2 X2 Biologie Moléculaire • Séquençage • PCR : Polymerase Chain Reaction • Sur ADN • Sur ADN complémentaire RT-PCR n Cycles = 2n copies

29. PRAD1/BCL1/CCND1 D1 D2 D3 Biologie Moléculaire 14q32 • Recherche d’équivalent moléculaire de translocation • IgH-Bcl1 et t(11;14) • IgH-Bcl2 et t(14;18) • Recherche d’expression dérégulée d’un gène • Cycline D1 (t(11;14)) • Recherche de transcrit de fusion • BCR-Abelson et t(9;22) m d g a e VH DH JH 120kb 11q13 RT-PCR quantitative (RQ-PCR) pour le suivi des patients

30. Culture des progéniteurs hématopoïétiques EEC CFU-E EEC = endogenous erythroid colonies Formation des colonies érythroïdes « spontanées » in vitro

31. Conclusion : Orientation Diagnostique Hyperlymphocytose ou Lymphocytes atypiques Syndrome mononucléosique Cytométrie en Flux Lymphome T Monotypie douteuse CD19+5+ Monotypie CD19+5- Monotypie Score bas 0-1-2-3 Compléments CMF Score 4-5 Score 1-2-3 LNH Folliculaire LNH Zone marginale L. à Tricholeucocytes SLVL LNH lymphoplasmocytaire L. Prolymphocytaire B (Galton) LNH du Manteau SLPC CD5+ (LLC atypique ou autre) LLC typique : diagnostic positif Immuno- phénotypique Examens spécialisés complémentaires Cytogénétique FISH Biologie Moléculaire Anatomie pathologique