IN SITU MELEZLEME (HİBRİDİZASYON)

1. IN SITU MELEZLEME(HİBRİDİZASYON)

2. lnsitumelezleme (hibridizasyon) (lSH), • Nükleik asit dizilerinin (DNA ve RNA) morfolojik olarak korunmuş kromozomlar, hücreler veya doku kesitlerinde saptanarak gösterilmesini sağlayan ve temel olarak çift iplikli nükleik asit oluşumu esasını kullanan bir tekniktir. • lSH’da nükleik asitler kendi hücresel ortamlarında gösterilir.

3. DNA Zinciri Açılabilir

4. Merkezi Dogma

5. Bir proteinin üretilebilmesi için ilgili genden mRNA üretilmelidir. • Eğer bir dokuda ilgilendiğiniz mRNA üretiliyorsa bu, o dokuda ilgili genin aktif olduğunu yani genin okunduğunu gösterir. • mRNA’yı belirleyebilirseniz hangi genin okunduğunu kolayca anlayabilirsiniz.

6. Antisense RNA • RNA zincirinin komplomenteri zincir

7. AntisensmRNA’lar protein sentezini durdurmak amacıyla kullanılabilir

8. Tek zincirli DNA ve RNA nasıl belirlenir?

9. Kromozom üzerinde hibridizasyon

10. Etiketler • Digoxigenin (DIG, Roche) • Sıklıkla kullanılır • Antikorlar tarafından belirlenir • Biotin • Avidin ile belirlenir • 2,4-dinitrophenyl (DNP, PerkinElmer) • Floresans etiketler

11. Enzimler • Alkalin fosfataz • En hassas görüntüleme sistemidir • Bazı memeli dokularında mevcuttur • En yaygın substratı: NBT/BCIP (nitroblue tetrazolium / 5-bromo-4-chloro-3-indolyl phosphate), koyu mavi renk • Floresanssubstrat: ELF-97 (Molecular Probes) • Peroksidaz • Değişik memeli dokularında bulunur • Yaygın substratı: DAB (diaminobenzidine), kahverengi

13. Nükleik asitlerin hücredeki yerlerinde saptanması ne işe yarar? • Kromozomların fiziksel haritalarının yapılmasında, • Kromozom yapı ve hatalarının analizinde, • Kromozomların ve genomun yapıve işlevinin araştırılmasında, • Gen anlatımının belirlenmesinde, • Eşey tayininde, • Dokudaki virüs ve bakterilerin tanısında, • Transformasyon dizilerinin ve onkogenlerin yerlerinin belirlenmesinde önemlidir.

14. ISH’ın başlıca aşamaları

15. MateryaleUygulananÖnİşlemler Hibridizasyondan önce, • Probunhedefolmayannükleikasitlerlemelezlenmesiniengellemek • Proteinlerleveyadiğerelemanlarlaspesifikolmayanetkileşimleriazaltmakiçin materyaleaşağıdaki işlemler uygulanır: • RNazUygulaması • Asetilleme • DokuyuGeçirgen Hale Getirme(Permeabilizasyon) • Endojenenzimlerinetkisiz hale getirilmesi • Melezlemeöncesifiksasyon

16. RNazUygulaması DNA dizilerinisaptamakamacıylayapılançalışmalardasitoplazmavenükleusdakiRNA’larınproblamelezlenmesiniönlerveendojenRNA’nıntemizlenerekistenmeyenzeminboyanmasınıazaltmayısağlar.

17. Asetilleme Bu işlemgenellikle RNA/RNA ISH içinuygundur. Trietanolamin+asetikanhidriduygulamasıyla asetilleme(+) yüklü moleküllerinötralleştirirvepoli-L-lizinkaplılamlarkullanıldığınaprobunlama özgünolmayanbağlanmalarınıönler.Endojenbiyotini de yokeder (Aksihaldezeminboyanmasınanedenolabilir)

18. DokuyuGeçirgen Hale Getirme (permeabilizasyon) • ProteazUygulaması Proteazlar (pronaz E, proteinaz K, pepsin/HCl) prob ve saptama belirtecinin dokuya girebilmesine yardım eder. Hedef nükleik asitleri maskeleyen proteinleri sindirerek etki ederler. Proteolitik enzim uygulaması dikkatli bir şekilde kontrol edilmelidir. Konsantrasyon yetersiz olursa normalin aItında melezleme gerçekleşir; bu durumda konsantrasyon artırılabilir. Morfolojinin bozulması halinde ise konsantrasyonun düşürülmesi gerekir.

19. HClUygulaması Bazı yöntemlerde kullanılır. Kesin etkisi bilinmemekle beraber proteinlerin ekstraksiyonunu ve hedef dizilerin kısmen hidrolizini sağlayarak sinyalin artmasına katkıda bulunduğu düşünülmektedir. • DeterjanUygulaması Diğer işlemlerin lipidekstraksiyonunda yetersiz kaldığı düşünüldüğünde kullanılır. Triton X-100, sodyum dodesil sülfat

20. EndojenEnzimlerinEtkisiz Hale Getirilmesi Prob işaretleyici olarak herhangi bir enzim kullanılmış ise dokudaki endojen enzim etkisiz hale getirilmelidir. Örneğin, peroksidaz için, kesitlere % 1 H2O2, alkalin fosfataz için substrat solüsyonuna levamisol eklenir.

21. MelezlemeÖncesiFiksasyon(prehibridizasyon) Proteaz uygulamasından sonra materyali paraformaldehit ile tekrar fikse etmek yararlı olur. Melezleme öncesi fiksasyon hücredeki DNA ve RNA'nın daha sonraki işlemler sırasında kaybını önlemek için yapılır.

22. lnsitu Melezleme Problarının Seçimi lSH'da kullanılacak probların seçilmesinde iki temel nokta vardır: • Prob olarak kullanılacak nükleik asidin tipi • Uygun işaretleme cinsi

23. Prob Tipleri • Prob olarak hazırlanan nükIeik asitler; çift iplikli DNA (dsDNA), tek iplikli DNA ssDNA), tek iplikli RNA ve oligonükleotidler olarak sınıflandırılabilirler . • Kromozomlar üzerinde gerçekleştirilen lSH'da ve viral DNA tayinlerinde genellikle DNA probları, • mRNA tayinlerinde ise tek iplikli RNA probları veya oIigonükleotidler tercih edilmektedir. Problar izolasyon/ klonlama, in vitro transkripsiyon veya kimyasal sentez yolu ile elde edilebilirler.

24. Prob Tipleri DNA probları: • Yüksekspesifikaktivite gösterir. • Prob olarakkullanılmadanöncedenatüre edilmelidir. RNA probları: • RNA-RNA hibridleri en stabilhibridlerdir. • RNA probları düşük stabilite gösterirve RNaz’larlakolaylıklayokedilebilirler. Oligonükleotidprobları : • Dizihedefdiziyetamamlayıcıolarakdizaynedilir. • Problarçok stabildir. • Küçük boyutundandolayıhedefekolaycagirebilir.

25. Prob Uzunluğu Maksimum melezleme oranı uzun problar ile elde edilir. Ancak lSH'da kısa problar gereklidir. Çünkü, probun hücre veya kromozomlar çevresindeki yoğun matriksten geçerek hedefe ulaşması gerekmektedir. Probların 500 ve üzerinde baz uzunluğuna sahip olanları birçok doku için en iyi sinyali verir. Çok kısa problar ise çok zayıf sinyal verirler, bazen de istenmeyen işaretlere neden olabilirler. Dokunun özelliği, fiksasyon tipi, melezleme öncesi işlemlerinin uygulanıp uygulanmamasına göre de probuzunIuğunun seçimi değişir. OligonükleotidIer tek iplikli oluşları ve çok iyi penetrasyon özelliklerine sahip olmalarından dolayı lSH için oldukça avantajlı problardır.

26. Probun İşaretlenmesi • İzotopik işaretleme • İzotopik olmayan işaretleme

27. İzotopik İşaretleme • İşaretleme radyoaktif madde ile yapılır ve işaretin belirlenmesi için otoradyografikullanılır. Reaksiyon sonucunun hızına, probstabilitesine ve çalışılan konuyagöre farklı tipte izotoplar kullanılır. H3 işaretli problar; subsellüler uygulamalar kullanılır, yüksek çözünürlüğe sahiptir. İşaretli problar birkaç yıl saklanabilir. S35lSH'da en yaygın olarak kullanılan radyoaktif işaretlemedir. S35 işaretli problar, özellikle hücresel uygulamalar için uygundur. Otoradyografi işlemi 1 hafta sürebilir. İşaretli prob birkaç ay içinde tüketilmelidir. P32, geniş çaplı alanlar için uygulanır. İşaretli problar bir hafta kullanılmalıdır.

28. İzotopik Olmayan İşaretleme, • İşaretleme radyoaktif olmayan maddelerle yapılır ve işaretin tayini için immünohistokimyasalyöntemler kullanılır. İzotopik olanlara göre avantajları, • İşaretli probların 6 ay veya daha uzun süreli olarak -20°C'dasakIanabilmesi, • çözünürlüğün yüksek olması, • hızlı sonuç alınması, • daha fazla sayıda işaretleme yöntemi bulunması ve • daha güvenilir olmasıdır. Dezavantajları ise; duyarlılığının izotopik işaretlemelerden daha az olması ve istenmeyen bağlantılara daha fazlayol açabilmesidir.

29. Prob işaretlemeleri kimyasal veya enzimatik reaksiyonlarla yapılır. En yaygın kullanılan işaret maddeleri;

30. lSH'da Kullanılan ProblarınEnzimatikİşaretlenmeleri

31. Hapten işaretli problarmRNAlSH için güvenilirlik, yüksek stabilite, hızlı sonuç verme ve tek hücre çözünürlüğü gibi avantajlara sahiptirler. En duyarlı yöntem, özgün bir antikora uygun olan bir haptenin, bir nükleotid türevine bağlanması ile gerçekleştirilir (örneğin, digoksigeninddUTP veya dUTp'ye bağlanır) Melezleme ve yıkamaları takiben doku bir enzime bağlı olan ve hapteni bağlayan bir protein ile inkübe edilir. Daha sonra sinyal bu enzim için uygun substratın kullanılması sonucunda, ürünün renklendirilmesi şeklinde elde edilir. Bu işlem fluoresein işaret maddesinin kullanımı için de benzer şekildedir. İşaret fluoresan mikroskobunda gözlenir.

32. Denatürasyon, MelezlemeveYıkamalar • MelezlemeÖncesiİşlemler (Prehibridizasyon) Zemin boyanmasını önlemek için genellikle prehibridizasyon gereklidir. Prehibridizasyon solüsyonu, prob ve dekstran sülfat dışında melezleme karışımındaki tüm elemanları içerir.

33. Denatürasyon DNA/DNA ISH için prob ve hedef dizilerin denatürasyonu gereklidir. Denatürasyonasit, ısı veya alkali uygulamasıyla yapılır. Alkali maddeler biotinliproblarla kullanılmaz. lsı ile denatürasyon, uygulamanın basitliği ve daha etkili oluşu nedeniyle en çok kullanılan yöntemdir. Denatürasyon işlemleri genellikle morfoloji kaybına neden olur. Bu nedenle, hedef DNA'nın denatürasyonuprobdenatürasyonuna göre daha kritik bir işlemdir.

34. Melezleme (Hibridizasyon) Prob ve hedef nükleik asitler tek iplikIi hale getirildikten sonra, DNA/ DNA melezleri için 37°C’ da ve RNA/RNA melezleri için 50-55°C'da bir gece inkübasyona bırakılırlar. Bu sıcaklıklar genellikte Tm değerinin 20-25°C altındadır. Radyoaktif lSH'danükleik asit probunun her kilobazı için 0.1-0.3 ngµl-1 prob konsantrasyonu önerilmektedir. Prob ne kadar uzunsa konsantrasyonu da o kadar yüksek olacaktır. Genellikle radyoaktif olmayan yöntemlerle işaretlenmiş problar daha yüksek konsantrasyonlarda (klonlanmış problar için 0.5-2.0 ngµl-1, genomikproblar için 1.5-5.0 ngµl-1 ) kullanılır.

35. İşaretlenmiş nükleik asit probları, formamid, dekstran sülfat, bloke edici DNA veya tRNA, sodyum dodesil sülfat, sığır serum albumini ve çeşitli tuzlar içeren bir melezIeme karışımı içine konur. • Formamid, denatürasyon ve melezleme solüsyonlarında kullanılır. Reaksiyonun doku morfolojisini bozmayacak bir sıcaklıkta gerçekleşmesini sağlar ve aynı zamanda reaksiyonun özgünlüğünü de etkiler. • Dekstran sülfat, melezlenme oranını artırır. Kuvvetli su çekici özelliği ile melezleme solüsyonunda bir matriks oluşturur. Prob bu matriksin dışında kalır ve konsantrasyonu artar

36. İşaretlenmemiş bloke edici DNA ve tRNAprobun özgün olmadığı bölgelerde melezlenmesini önlemek için kullanılır. Bunlar genellikle som balığı sperm DNA'sından elde edilmektedir. Bu diziler, dokudaki pozitif yüklü elemanlarla elektrostatik bağlar oluşturur ve prob ile bu tip bağlantıların oluşma olasılığını azaltır. • Sodyum dodesil sülfat (SDS), probun dokunun içine girmesine yardım eder. • Sığır serum albumini (BSA), probun dokuyla özgün olmayan etkileşimlerini azaltır. • Tuzlar, melezleme ve denatürasyon solüsyonlarının iyonik gücünü ayarlar ve nükleik asit melezlerini sağlamlaştırır.

37. Melezleme oranı prob uzunluğuna, konsantrasyonuna ve dizinin kompleksliğine bağlıdır. Genellikle uzun problar materyal içine difüzyonun güçlüğü nedeniyle daha yavaş melezlenmeye sebep olur. Melezleme oranı dekstran sülfat kullanılarak artırılır. Melezlenme yaklaşık 3-5 saatte tamamlanmakla beraber, bir gece inkübasyon daha uygundur.

38. Reaksiyonun kesinliği ve kuvveti Bir lSH deneyinin kesinliği ("stringency") prob ve hedef nükleik asitteki hatasız eşleşen nükleotid oranını belirler. Reaksiyonun kesinliği sıcaklık, iyonik şartlar ve formamid gibi, çift sarmalı ayıran moleküllerin melezleme karışımı ve melezleme sonrası yıkama solüsyonlarındaki konsantrasyonu ile kontrol edilir. Reaksiyon sıcaklığı yüksek ve katyon konsantrasyonu düşük ise bu koşullar yüksek kesinlik koşullarıdır ve reaksiyonun özgünlüğü artar. Aksine reaksiyon sıcaklığı azaltılır, yüksek katyon konsantrasyonları uygulanırsa (düşük kesinlik koşulları) başka homolog diziler ile eşleşme gerçekleşebilir, yani reaksiyonun özgünlüğü azalır.

39. Melezlenme Sonrası Yıkamalar (Posthibridizasyon) Melezleme sonrası yıkamalar zayıf bağlanan probu temizlemek ve sadece doğru eşleşmiş olanları bırakmak amacıyla uygulanır. Genellikle önce düşük sonra yüksek "stringency" yıkamaları yapılır. Böylece önce zayıf melezlenmiş veya melezlenmemiş prob ve melezleme solüsyonunun diğer elemanları temizlenir; daha sonra tuz konsantrasyonu düşük ve sıcaklığı yüksek yıkamalar ile probun melezleme özgünlüğü son bir kez düzenlenmiş olur. RNA/RNA melezlemesi için ek bir işlem daha uygulanır. RNA probları yapışmaya eğilimlidir ve bu nedenle yoğun zemin sinyali oluştururlar. Bu amaçla melezleme sonrası RNaz uygulaması yapılır.

40. lnsitu Melezleme Bölgelerinin Saptanması Yıkama işleminden sonra melezleme bölgeleri saptanır. Saptama ve görünür hale getirme yöntemleri probu işaretlemede kullanılan işaretleyicinin tipine bağlıdır. Radyoaktif işaretli probların saptanması için otoradyografikyöntemler, radyoaktif olmayanlar için ise immünohistokimyasalyöntemler kullanılır.

41. radioactivein situ Hybridization 35S labelled probe mRNA

42. Radyoaktif Olmayan Probların Saptanması Doğrudan ve dolaylı olmak üzere iki çeşittir. Doğrudan yöntemde işaret, doğrudan doğruya nükleik asit probuna bağlanır ve hedef nükleik asitle melezlemeden hemen sonra mikroskop altında görülebilir. Doğrudan yöntemlerde prob ile işaretleyici molekül arasındaki bağın melezleme ve yıkamalar sırasında uygulanan oldukça tahrip edici koşullara dayanması temeldir. Ayrıca işaretleyici molekülün melezleme reaksiyonunu engellememesi gereklidir.

43. Dolaylı yöntemde proba bağlanan işaretleyici molekül doğrudan doğruya görülemez. Melezlemeden sonra ikinci bir molekül (haberci molekül) probdaki işaretleyiciye bağlanır ve böyIeceprobunmelezIenme bölgeleri görünür hale getirilir. Bu yöntemde de probu işaretleyici molekül, melezleme reaksiyonunu engellememelidir. Ayrıca haberci molekülün kolay saptanabilmesi gereklidir.

44. Radyoaktif olmayan prob işaretlerinin çoğu immünojeniktir ve immünohistokimyasalyöntemler ile saptanabilir. En çok kullanılan radyoaktif olmayan işaretler biotin ve digoksigenindir. Bunlar kendilerine karşı oluşturulan antikorIar (örneğin, antidigoksigenin) ile saptanabilirler. Biotin için ise iki saptama sistemi vardır; bunlar anti-biotin antikorIarı ve biotin-(strept)avidin sistemleridir.

45. İmmünohistokimyasal Yöntem Probla melezlenme bölgeIerinin görülebilmesini sağlayan, sinyal oluşturan sistemler (haberci moleküller), işarete karşı oluşturuIan birincil (primer) bir antikora bağlanabilirler. Bu yönteme tek aşamalı saptama yöntemi denir.

46. İki aşamalı yöntem ise primer antikorun elde edildiği türe karşı oluşturulan ikincil (sekonder) bir antikor, haberci molekülü taşımaktadır. Bu yöntem tek aşamalı olana göre genellikle daha duyarlıdır. Çünkü her primer antikora sinyali taşıyan birkaç sekonder antikor birden bağlanabilir

47. Biotin - (strept)avidin sistemi Avidin yumurta akından elde edilen ve biotine karşı aşırı ilgisi olan bir glikoproteindir. Haberci molekülü veya sinyali içeren avidinbiotin işaretli proba bağlanır (1) (2) Biotinliantiavidin antikoru eklenir (3) Sinyal oluşturucu sistemi içeren başka bir avidin tabakası eklenerek sinyal artırılır.

48. Bu şekilde sinyal ileri derecede artırılmış olur. Avidinin yerine kullanılabilen streptavidin ise Streptococcusavidini'den elde edilir. Avidinden farklı oIarak yüksüz bir moleküldür ve özgün olmayan elektrostatik bağlanmalar daha az oluşur. Bununla beraber biotine ilgisi avidininkine göre daha azdır ve daha dayanıksızdır.

49. Sinyal oluşturan sistemler (haberci moleküller) ProbmelezIemebölgeIerinin görünür hale gelmesi, antikora veya (strept) avidine bağlanan sinyal oluşturan sistemlerle (haberci moleküllerle) sağlanır. Bu sistemler fluorokromlar, enzimler ve metaller olmak üzere üç temel gruba ayrılır 17-aminometil-kumarin-3-asetik asit; 2fluoresein izotiyosiyanat

50. Fluorokromlar Uygun dalga boyundaki ışıkta fluoresan yayan fluorokromların streptavidine veya antikorlara bağlanabilen çeşitli tipIeri vardır. En çok kullanılanlar; • fluoreseinizotiyosiyanat (FITC) yeşil, Teksas kırmızısı ve rodamin kırmızı, • amino-metil- kumarin asetik asit (AMCA) ise mavi renkte fluoresan yayarlar. • yüksek duyarlılık, • çözünürlüğün daha iyi oluşu, • kantitatif çalışmaya uygunluğu • birden fazla probun aynı anda saptanması • bu yöntemin üstünlükleridir morfolojik görüntünün zayıflığı, sinyalin çabuk solması nedeniyle sonuçların hemen fotoğrafla saptama zorunluluğu gibi bazı sakıncaları vardır.