Genotoxicitás Mutagén hatások Ames mutagenitási vizsgálat In vivo mikronukleusz

1. Genotoxicitás Mutagén hatásokAmes mutagenitási vizsgálatIn vivo mikronukleusz Tarnóczai Tímea Országos Kémiai Biztonsági Intézet 2011. 11. 17.

2. A genotoxikológia az emberrel közvetlenül kapcsolatba kerülő anyagok mutagén hatását vizsgálja. • Genotoxikus anyagok a DNS-ben tárolt genetikai információt örökletes módon megváltoztatják. • Mutáció: Egy tulajdonság egy nemzedéken belül ugrásszerűen, és öröklődő módon megváltozik.

3. Mutációk csoportosítása eredetük szerint: • spontán mutáció: természetes körülmények közt minden fajra jellemző gyakorisággal lép fel. Prokariótáknál nagyobb, mint az eukariótáknál pl. tautomerizáció, spontán deamináció • indukált mutáció: környezeti hatásra létrejövő ill. kísérleti körülmények között kiváltott mutációk. • Mutációk csoportosítása az érintett sejtvonal szerint: • szomatikus • germinális • Mutációk csoportosítás a hatópont szerint: • gén- v. pontmutációk • Tranzíció: purin-purin vagy pirimidin-pirimidin csere (A→G, G →A vagy T→C, C →T) • Transzverzió: purin-pirimidin vagy pirimidin-purin csere (A →T, A →C, G →T, G →C vagy T →A, T →G, C →A, C →G) • Inszerció, deléció: Egy vagy két bázis betoldása vagy kiesése (olvasási keret megváltozása) • kromoszóma mutációk

4. Pontmutáció hatása a géntermékre: csendes mutáció: A triplet utolsó bázisa változik, de ugyanazt kódolja. • AGT (Ser) →AGC (Ser) • semleges mutáció: A kódolt aminosav hasonló jellegűre változik, ezért a fehérje szerkezetét és funkcióját nem feltétlenül érinti. • AAA (Lys bázikus) →AGA (Arg bázikus) • misszensz mutáció: Egy báziscsere miatt másik nem funkcióképes aminosav kódja keletkezik. GAG (Glu savas)→GTG (Val semleges) • nonszensz mutáció: Egy báziscsere miatt STOP kód keletkezik. • TAC (Tyr) →TAG (Stop) • kereteltolódási mutáció (frameshift): Egy vagy két bázis kiesése vagy hozzáadódása miatt elcsúszik a leolvasási keret. A

5. Bázis tautomerizáció (spontán m.) Guanin és timin keto formában Adenin és citozin amino formában A guanin enol formája timinnel, az adenin imino formája pedig citozinnal képes H-híd kialakítására. A citozin imino formája adeninnel, a timin enol formája pedig guaninnel képes H-híd kialakítására. A párosodási hiba a replikáció során az újonnan szintetizált szálban megmarad és állandósul

6. Mutagén tényezők • sugárzás (röntgen, ultraibolya, radioizotópok)molekulákat gerjesztik és ionizálják, sejtben sok vízmolekula→szabadgyökök • kémiai anyagok: • hatásmechanizmusok alapján lehetnek: bázisanalógok interkaláló vegyületek alkiláló vegyületek deamináló vegyületek szabadgyököt képező vegyületek nehézfémek DNS-szintézis inhibitorok

7. Bázisanalógok: A természetes bázisokhoz hasonló szerkezetűek, a DNS polimeráz beépíti a kettős spirálba pl. 5-brómuracil (5BU) : timin analóg adeninnel és guaninnal is képes párosodni, tranzíciót okoz • Deamináló szerek: indukált deaminációt okoz (aminocsoport→oxocsoport) pl. salétromossav citozin→uracil, mely a következő replikáció során adeninnel párosodik és C-G > T-A tranzíciót okoz

8. Alkiláló szerek: alkil (-CH3, -CH2-CH3) csoportokat építenek a nukleinsavak bázisaira és azokat módosítják pl.etil-metánszulfonát(EMS) főként a guanint, kisebb mértékben a timint módosítja • a 6-etilguanin timinnel párosodik, ami C-G>T-A tranzíciót eredményez • a 4-etil-timin a guaninnal párosodik, és így T-A>C-G tranzíció jön létre

9. Vegyiparban használt köztes és végtermékek: epoxidok etilén-iminek acetaldehid akrilaldehid Propán-szulfon Dimetil-szulfát Dietil-szulfát dimetil-nitrózamin hidrazinok uretán Etilén-klorid Vinil-klorid élelmiszeradalékok: nitritek nitrátok nátriumbisziulfit ciklohexamin kozmetikumok: hajfesték (nitrofenilén-diamin) H2O2 femnilén-diamin diaminotoluol diaminoanizol gyógyszerek: citosztatikumok altató és nyugtató szer fertőtlenítőszerek (formaldehid, H2O2) növényvédőszerek, herbicidek, insecticidek: klórozott szénhidrogének szerves-foszforsav észterek karbamidok, karbamátok, ftálamidok, szerves higanyvegyületek • Környezeti mutagén anyagok Levegőszennyezés: policiklikus aromás szénhidrogének Szervetlen mikroszennyezők: nehézfémek azbeszt Szerves mikroszennyezők: gomba és baktériumok által termelt toxinok

10. Bakteriális reverz mutagenitási vizsgálat • Bruce Ames 1970-es évek elején • Pontmutációt okozó kémiai anyagok észlelésére alkalmas • Daganatos betegségek, fertilitási problémák, genetikai betegségek (pl. albinizmus) • Mutáns prokarióta sejtek (Escherichia coli és Salmonella typhimurium) • Aminosav szintetizáló képesség károsodott • A kémiai anyag által okozott mutáció ezt a képességet állítja vissza (back mutáció vagy reverzió) • Spontán módon is visszafordulhat a mutáció (spontán revertánsok-negatív kontroll)

11. Különbözik az emlőssejtektől (metabolizmus, kémiai anyagok felvétele, kromoszómaszerkezet) Metabolikus aktivizálás kívülről Citokróm P450 metabolikus oxidációs rendszer Kísérleti állatok kezelése Enzim termelődésének növelése→inducer S9 mikroszóma frakció + NADP + kofaktorok Nem mindig alkalmazható (baktericid vegyületek) Előinkubációs és lemezöntéses módszer Speciális anyagoknál módosítások

12. Teszttörzsek • E. coli triptofán mutáns (WP2 uvrA), S. typhimurium hisztidin mutáns (TA98, TA100, TA1535, TA1537) • Mutációk a hisztidin és triptofán operon különböző részén (más-más törzsek) • Hisztidin és triptofán mentes táptalajon inkubálás • Back mutáció hatására aminosav hiányában is nőnek • Negatív és pozitív kontroll kell

13. Egyéb genetikai módosítások • Cél az érzékenység növelése • Rfa mutáció: nagy molekulasúlyú anyagok bejutása (ellenőrzés kristályibolyával) • uvrA/uvrB mutáció: DNS javító mechanizmus mutációja • pKM101 plazmid: Kémiai és UV-besugárzás szembeni érzékenység növelése, ampicillin rezisztencia • Törzsek ellenőrzése szükséges

14. Alkalmazott törzsek genotípusa

15. Alkalmazott törzsek fenotípusa

16. A vizsgálat menete • 10 órás szuszpenziós tenyészet készítése • Másnap kémcsőben tenyészet + puffer + kontroll vegyület/teszt anyag + top agar • Minimál agaros Petri-csészére önteni • Top agar megszilárdulása • Inkubálás 48-72 óráig 37°C-on • Előinkubáció esetén top agar nélküli keverék inkubálása (előinkubáció ideje 20-40 perc) • Telepszámolás, mikroszkópos értékelés • Eredmények értékelése (szignifikáns emelkedés/statisztikai értékelés)

17. (Mutagén anyag vizsgálata)

18. Ampicillin rezisztencia, kristályibolya- és UV-érzékenység (tápagar) Aminosav igény ellenőrzése (minimál agar) Spontán mutáció (negatív kontroll) Indukált mutáció (pozitív kontroll) A fényképek az OKBI MSBO laboratóriumában készültek 2011-ben.

19. Negatív kontroll, normál baktériumpázsit 25μg/lemez glutáraldehid toxikus hatása A fényképek az OKBI MSBO laboratóriumában készültek 2011-ben.

20. Ames II. • módosított Ames vizsgálat • 96 v. 384 lyukú mikrotiter lemez • TA 98 (frameshift) és TAMix (6 törzs, bázispár szubsz.) • baktériumok + teszt anyag + hisztidin = savas közeg, melyet a pH indikátor festék érzékel (lilából sárgába vált) • automatizált, kisebb mennyiség is elég

21. In vivo mikronukleusz • Genotoxikus károsodás vizsgálata eritrocitákon • Kromoszómakárosodás következtében kialakuló mikronukleusz megléte • Mikronukleusz: membránnal határolt teljes kr. vagy kr. darab • Emlős csontvelőben vagy perifériális vérben • OECD Guideline 474 (a) a mikronukleusz acentrikus kromoszóma fragmensből származik (b) a mikronukleusz egész kromoszómát tartalmaz

22. A csontvelőben történik az vörösvérsejtek érése Normoblast→polikromáziás eritrocita fejlődés során a mag kipréselődik a sejtből Ha keletkezett mikronukleusz, azt az polikromáziás eritrocitában láthatjuk A mikronukleusszal rendelkező polikromáziás eritrocitaszám emelkedés megemelkedett kromoszómális károsodásra utal

23. Állatok kezelése intraperitoneálisan vagy per os (szájon át) • Kontroll (negatív és pozitív) és kezelt csoport (több dózis, hím és nőstény állatok) • Megfelelő oldószer kiválasztása: ne legyen toxikus, ne lépjen reakcióba a tesztanyaggal • Kezelés egyszer→leölés és csontvelő kivétele (24 és 48 órával a kezelés után) • Perifériális vérminta esetén vérvétel kétszer (36 és 72 órával a kezelés után) • Femur preparálás→csontvelő fötális borjúsavóba→centrifugálás→kenetkészítés

24. Kenetkészítés után festés (May-Grünwald és Giemsa) Egy polikromáziás eritrocita az érett eritrociták (normociták) között Polikromáziás eritrocita mikronukleusszal és anélkül

25. Értékelés mikroszkóppal • Először polikromáziás eritrocita (PCE)/normocita(NCE) arány meghatározása (100 db PCE leszámolás) • 2000 PCE közül mennyiben van mikronukleusz • PCE/NCE arány 0,1 felett kell legyen • A vizsgálat végén az alább adatokra lesz szükség: MPCE/2000 PCE, NCE/ 100 PCE, PCE/NCE arány • Statisztikai értékelés