福建农林大学生命科学学院福建省农业科学院农业生物资源研究所 2013年1月7日

短短芽胞杆菌FJAT-0809-GLX突变体库的构建及其抗菌益生功能初步分析短短芽胞杆菌FJAT-0809-GLX突变体库的构建及其抗菌益生功能初步分析指导老师：刘波博士、研究员副导师：车建美博士、副研究员研究生：黄丹丹福建农林大学生命科学学院福建省农业科学院农业生物资源研究所 2013年1月7日

内容提要 国内外研究现状与趋势研究意义研究目标和内容研究方法和技术路线研究可行性分析及创新点研究进度安排研究基础已具备的研究条件

一、国内外研究现状与趋势 1、短短芽胞杆菌形态学特性菌落形态电镜形态菌体形态 • 菌体：菌体杆状、革兰氏阳性、产芽孢、周生鞭毛、菌体约为0.8μm-2.2μm； • 菌落：NA培养基上，菌落浅黄色、无光泽、不透明、电镜下菌落呈放射状褶皱。

一、国内外研究现状与趋势 2、微生物遗传育种研究 • 物理诱变：紫外、微波、超声波、激光、离子辐射诱变等。 • 化学诱变剂：烷化剂、亚硝酸胍、硫酸二乙酯等。 • 物诱变包括转化、转座、原生质体融合等方式。 • 复合诱变：一般为物理诱变和化学诱变的综合。物理诱变不同诱变育种方式文本化学诱变生物诱变复合诱变

一、国内外研究现状与趋势 Tn10 转座子类型 Tn917 Tn5 mariner 类家族 3、转座子体内随机突变芽孢杆菌研究 • Tn917：链霉素、卡那霉素、红霉素抗性基因 • Tn10:四环素抗性基因 • Mini-Tn10：红霉素、壮观霉素抗性基因

一、国内外研究现状与趋势 4、短短芽胞杆菌活性物质研究胞外多糖几丁质酶活性物质短杆菌肽羟苯乙酯内毒素酯酶

一、国内外研究现状与趋势 生物防治工业应用环境治理表达受体 5、短短芽胞杆菌的应用石油开采灭蚊晶体蛋白Cry11A蛋白 • 防治白菜灰霉病菌 • 抑制重金属吸收，促生长 • 防治青枯雷尔氏菌 • 防治棉花立枯病、枯萎病 • 降解苯酚 • 降解六氯甲烷

一、国内外研究现状与趋势 6、本实验室相关的研究现状 • 筛选得到短短芽胞杆菌FJAT-0809-GLX • 菌株的鉴定 • 生物学特性研究 • 具有抑菌保鲜功能

一、国内外研究现状与趋势 FJAT-0809-GLX 硫酸链霉素清水对照 7、本实验室相关的研究现状 —短短芽胞杆菌活性物质分析羟苯乙酯邻苯二甲酸二丁酯邻苯二甲酸单(2-乙基己基)酯

二、研究意义 • 建立短短芽胞杆菌突变体库构建体系 • 筛选抗菌活性更高的生防菌株，或其他相关功能的目标菌株，应用于农业生物防治中，减少农业生产成本，提高产量。 • 扩大短短芽胞杆菌在生物防治上的抑菌谱和提高保鲜上的抗菌功能。

三、研究目标和内容 （一）研究目标（1）确立短短芽胞杆菌突变体库构建的方法，筛选出抗菌活性高的突变子；（2）确立短短芽胞杆菌突变子抗菌益生功能的初步分析方法。

三、研究目标和内容 （二）研究内容（1）短短 1、短短芽胞杆菌FJAT-0809-GLX突变体库的构建紫外诱变转座诱变筛选高抗菌活性的突变子

三、研究目标和内容 2、短短芽胞杆菌突变子的抗菌益生功能分析生物学特性活性物质生物测定菌落形态生长曲线培养条件羟苯乙酯抗氧化剂表面活性剂抑菌谱生物保鲜动物益生

三、研究目标和内容 3、拟解决的关键问题（1）紫外诱变获得抗真菌活性较原始菌株更高的突变子。（2）电击转化获得有效转化子。（3）短短芽胞杆菌突变子抗菌物质活性检测及其对果实的保鲜作用。

四、研究方法和技术路线 1、短短芽胞杆菌FJAT-0809-GLX突变体库的构建紫外诱变抗菌初筛抗菌复筛差异显著性分析稳定性检测（1）紫外诱变筛选比原始菌株活性更高的突变子

四、研究方法和技术路线 质粒提取感受态细胞制备电击转化抗生素筛选分子检测高温诱导 1、短短芽胞杆菌FJAT-0809-GLX突变体库的构建（2）转座诱变转座质粒PIC333携带Mini-Tn10转座子。其长度为2.35kb，两端各有一段IS序列，具有对温度敏感的特性。分子检测高温诱导

四、研究方法和技术路线 2、短短芽胞杆菌突变子抗菌益生功能的初步分析（1）突变子生物学特性分析 • 突变子菌落形态 • 生长曲线的制作 • 培养条件的优化（初始pH、培养温度、溶氧量和转速）

四、研究方法和技术路线 羟苯乙酯粗提取，并做抑菌活性测定采用排油圈法进行表面活性剂活性测定对DPPH·和羟基自由基作抗氧化活性分析 2、短短芽胞杆菌突变子抗菌益生功能的初步分析（2）突变子活性物质特性研究

四、研究方法和技术路线 2、短短芽胞杆菌突变子抗菌益生功能的初步分析（3）生物测定抑菌谱测定，大肠杆菌、沙门氏菌、莲雾黑腐病菌、枇杷炭疽菌为指示菌做抑菌圈实验。生物保鲜，主要对新鲜的莲雾采用喷施和浸泡的方式进行保鲜研究，记录腐烂率。益生动物，以小白鼠为实验对象，将突变子菌株作为微生物饲料添加剂，观测小白鼠的日增重和健康状况。

生物学特性 紫外诱变菌落形态突变子特性及抗菌益生功能分析生长曲线高抗菌活性突变子筛选培养条件突变体库的构建短短芽胞杆菌- 活性物质特性羟苯乙酯表面活性剂抗氧化剂转座诱变生物测定抑菌谱生物保鲜动物益生四、研究方法和技术路线

五、研究可行性分析及创新点 （一）可行性分析 • 目前，短短芽胞杆菌FJAT-0809-GLX的紫外突变及初筛工作已经完成，获得两株抗菌活性较原始菌株高的突变子，说明本课题可以进行。 • 据报道，苏云金芽孢杆菌芽孢杆菌、枯草芽孢杆菌插入突变体库已成功构建，因此，短短芽胞杆菌转座突变具有可行性，且插入突变方法体系也已经初步建立。 • 突变子生物学特性研究、抗菌益生功能研究方法成熟，在前人研究的基础上可以完成。

五、研究可行性分析及创新点 （二）创新点在选材上，善于利用已有的材料开展实验研究。短短芽胞杆菌选自本实验检测的具有抗菌活性的菌株，且其菌体和菌体产生的短杆菌素等已经投入农业生产应用，这为本实验开展筛选抗菌活性更高的菌株提供了一个基础。研究方向上，具有创新性和实用性。目前，国内外关于短短芽胞杆菌突变体库的构建还没有相关文献报道，本实验为短短芽胞杆菌的遗传育种提供一种参考，另外诱变高抗菌活性的菌株还可以应用到农业生产中，加大生防效力。

六、研究进度安排 2012 2013 1-2 突变子稳定性检测 3 转座诱变 4 突变子研究 5 生物测定 6 数据整理及论文撰写 8 查阅参考文献 9 建立紫外诱变方法 10 建立转座诱变方法 11 条件摸索完成 12 紫外诱变

七、研究基础 1、短短芽胞杆菌FJAT-0809-GLX紫外诱变

七、研究基础 1、短短芽胞杆菌FJAT-0809-GLX紫外诱变致死率为80%左右时获得最佳正突变率

七、研究基础 2、短短芽胞杆菌特异性PCR鉴定 bp 1500 1500

七、研究基础 3、短短芽胞杆菌FJAT-0809-GLX突变子初筛筛选到两株抑菌圈活性明显高于原始菌株的突变子，复筛实验正在进行。

八、已具备的研究条件 本实验室拥有较强生物技术研究装备，拥有基因扩增仪电击仪、细菌鉴定仪、系列电泳仪、高速离心机、超低温冰箱、紫外分光光度计、凝胶成像仪、气相色谱仪、液相色谱、气质联用色谱等等，可以满足科研的需要。

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