Download
1 / 16
170 likes | 437 Views
8.2. ŠŪNU SUSPENSIJU KULTŪRAS Detalizēti šī tēma apskatīta grāmatā Калинин Ф.Л., Сарнацкая В.В., Полищук В.Е. Методы культуры тканей в физиологии и биохимии растений. Киев: Наукова Думка. 1980 .-488 с . , no 145.-177.lpp.
E N D
8.2. ŠŪNU SUSPENSIJU KULTŪRASDetalizēti šī tēma apskatīta grāmatā Калинин Ф.Л., Сарнацкая В.В., Полищук В.Е. Методы культуры тканей в физиологии и биохимии растений. Киев: Наукова Думка. 1980.-488 с., no 145.-177.lpp.
Suspensiju kultūru nozīmeŠūnu suspensijas izmanto gan teorētiskiem, gan praktiskiem mērķiem.Teorētiskiem – tas būtu augstāko augu šūnu metabolisma pētījumiem.Praktiski tās pielieto dažādu savienojumu rūpnieciskai ieguvei, kā alkoloīdi, steroīdi, glikozīdi, ēteriskās eļļas, fermenti, u.c.
Suspensiju kultūras sastāv no atsevišķām šūnām un šūnu agregātiem, tās tiek audzētas šķidrās barotnēs, kam speciāli pievada skābekli.
Iegūšana • Ļoti svarīgs ir izejas materiāls, t.i., kādu kallusa tipu izmanto.Atsevišķos gadījumos suspensiju kultūras iegūst no steriliem augu eksplantiem, kas šķidrā barotnē dediferencējas un veido kallusu, kas beigās sadalās atsevišķās šūnās, bet parasti iegūst no irdena kallusa gabaliņiem, kas sastāv no nediferencētām šūnām.
Faktori, kas iespaido kallusa disociāciju • Lai iegūtu irdenu kallusu, kas šķidrā barotnē viegli sadalās, lieto paaugstinātu auksīnu koncentrāciju un pazeminātu citokinīnu koncentrāciju, vai arī citokinīnus nelieto nemaz.Piemēram, audzējot Atropa beladonna kallusu, vajadzēja barotnei pievienot 0,5 mg.L-1 kinetīna un 2 mg.L-1 NES. Bet lai dabūtu irdenu kallusu, tā vietā lietoja fitohormonu kombināciju: 0,1 mg.L-1 kinetīna un 2 mg.L-1 NES. Savukārt zirņu sakņu kultūrai kallusa irdenumu panāca ar paaugstinātu rauga ekstrakta kombināciju un pazeminātu 2,4-D devu.
Šūnas vienu ar otru saista Ca pektāti. Lai tās atdalītu, var lietot arī tādu paņēmienu kā pievienot fermentu Ca pektātu sadalīšanai vai arī saistot Ca ar hellātiem.Par hellatēšanas aģentu var lietot, piemēram, amonija oksalātu. Northcraft norāda, ka amonija oksalāts 100 mg.L-1 koncentrācijā aerobās kultūras padara īpaši irdenas, un tādi kallusi viegli sairst.Acer pseudoplatanus suspensiju kultūra veido šķīstošos polisaharīdus (Becker, u.c.), ko tā izdala barotnē; šo polisaharīdu galaktouronskābes karboksilgrupa samazina polisaharīdu ķēdes sasaiti, kas noved pie īpaša kallusa irdenuma.
Suspensiju kultūra ir heterotrofa kā pēc morfoloģijas, tā arī bioķīmiski. Šūnu populācija parasti stipri variē kā pēc formas, tā pēc izmēriem. Pat smalki disperģēta suspensija sastāv no • 50-60% - atsevišķām šūnām, • šūnu grupām (2-10 šūnas), • daudzšūnu agregātiem (simtiem tūkstošu šūnu).
Maz ir tādu kultūru, kam piemīt nosacīta homogenitāte, kā, piemēram, Rosa sp. (Dougale, 1966; Nash, 1968), kas kultivējot veido nelielus agregātus. Liela nozīme ir barotnes sastāvam. Ja rožu suspensiju kultūrai barotnē pievieno galaktozi, rafinozi vai saharozi, tas veicina lielu agregātu veidošanos.Nevins un līdzautori vēl konstatējuši, ka cukuri šķidrajā barotnē var ietekmēt starpšūnu kontaktus, inducējot izmaiņas šūnapvalku virsmas polisaharīdos. Bet, protams, noteicošā loma ir un paliek fizioloģiski aktīvām vielām.
Bez barotnes sastāva būtiska nozīme ir • aerācijas veidam un • šķīduma maisīšanas ātrumam, • attiecībai starp svaigo biomasu un barotnes tilpumu, • subkultivēšanas biežumam, u.c.
Kultūrām, kas tendētas uz agregātu veidošanu, var pievienot barotnei pektināzi un celulāzi nelielā koncentrācijā. Piemēram, Acer pseudoplatanus suspensijai pievienojot 0,05% macerozīmu un 0,1% celulāzi, konstatēts, ka suspensiju augšana netika inhibēta, bet palielinājās kultūras dispersija (Street, 1977). Lai novērstu šūnu sieniņas destrukciju, vienlaicīgi ar celulāzi kultūrai kā osmotiķis jāpievieno 8%-īgs sorbīts.
Ja žeņ-šeņa kultūrai pievienoja 0,02% pektināzi un celulāzi vienlaicīgi ar 8% sorbītu, atsevišķo šūnu un nelielo agregātu daudzums no 24% palielinājās līdz 96% ( Бутенко, 1977). • Suspensiju kultūru iespējams iegūt ne tikai no kallusa, bet arī no vienas šūnas kultūras.
Suspensiju kultūras augšanas fāzesŠūnu populācijas augšanas cikls veido S-veida līkni. Šūnu skaits 5. Stacionārā fāze 4. 6.Atmiršanas fāze Agrā stacionārā fāze 3. Lineārā fāze 1. Lag- fāze 2. Logaritmiskā fāze Laiks
Praksē, protams, izmanto šūnas aktīvā augšanas un vairošanās fāzē. Ievadā jau runājām par šūnu kultūru izmantošanu sekundāro metabolītu ražošanā. Lai iegūtu lielu daudzumu ekonomiski svarīgu sekundārā metabolisma produktu, nepieciešami divpakāpju šūnu kultivēšanas etapi: • pirmajā etapā tiek radīti apstākļi, kas veicina šūnu biomasas optimālu uzkrāšanos, • otrajā etapā - šūnu kultivēšana noteiktā nosacīti stabilā stāvoklī speciālos režīmos (hemostatiskā vai turbodinamiskā).
