TD 1 les ckis et la différenciation des entérocytes

1. TD 1les ckis et la différenciation des entérocytes

2. Rappel Migration Différenciation

3. Rôle important de la Matrice extracellulaire dans la différenciation intestinale. Mais elle n’est certainement pas le seul stimulus de différenciation Autre hypothèse: le processus est dirigé par une horloge moléculaire intracellulaire.

4. p27(Kip1) is an inducer of intestinal epithelial cell differentiation.Quaroni A, Tian JQ, Seth P, Ap Rhys C. • Section of Physiology, Cornell University, Ithaca, New York 14853, USA • Am J Physiol Cell Physiol. 2000 Oct;279(4):C1045-57.

5. balance prolifération différenciation

6. Cyclin-dependent kinase inhibitors (CKI) Il en existe plusieurs: p27 Kip1 (p27), p21 Cip1/WAF1 (p21), p16… Corrélation entre l’expression de cki et le degré de différenciation. • surexpression de p21 dans les cellules intestinales différenciées • p27 dans les kératynocytes: l’augmentation de l’expression de p27 est concomittant avec la différenciation. Un oligonucléotide antisens de p27 inhibe la différenciation. • Rôle de p27 dans la différenciation des cellules intestinales?

7. Méthode • Utilisation de la lignée HIEC6: cellules issues de cryptes • Surexpression par infection de: • Vecteur seul Adnull • p16 Adp16 • p21 Adp21 • p27 Adp27 Analyse de la prolifération, des différentes phases du cycle cellulaire, de la morphologie des cellules, de l’expression de marqueurs de différenciation

8. Contrôle de l’expression des ckis Les cellules sont infectées à différentes concentrations d’adenovirus. Après 24 heures analyse des différentes protéines par Western blot

9. Contrôle de l’expression des ckis • Analyse par immunocytochimie de l’expression des ckis

10. Conclusions • L’infection des cellules par l’adenovirus + cDNA exogène induit l’expression des ckis • La surexpression de P21 entraine l’expression de P27 (P27 sous le contrôle de p21?)

11. Ckis et prolifération Incorporation de thymidine tritiée 24 heures après infection

12. Utilisation de la BrdU Brdu (bromodeoxyuridine) Ac X-Brdu Ac X-Ac X-Brdu

13. Ckis et prolifération B: effet dose de l’adenovirus C étude cinétique sur la prolifération

14. Conclusions • P16, P21 et P27 inhibent la prolifération • de façon dose-dépendante. • Plus d’efficacité pour P27, p21 puis P16 • L’effet de P27 est irréversible

15. Surexpression des cki et cycle cellulaire Pic G1-G0 Nombre de cellules Pic S Intensité de fluorescence Contenu en ADN

16. Cki et cycle cellulaire

17. Conclusions • P16, P21 et P27 augmentent la quantité des cellules en phase G0/G1et diminue le nombre de cellules en phase S

18. Cki et morphologie

19. Conclusions • L’expression des CKI entraîne: • p16: cellules polygonales mais pas de microvillosité • p27: cellules polygonales avec présence de nombreuses microvillosités. • p21: 20-40% des cellules sont polygonales avec des microvillosités. • p27 induit une différenciation morphologique

20. cki et expression de la DPP IV Protéine ARNm Activité enzymatique

21. cki et expression de la DPP IV

22. Conclusions • p27et dans une moindre mesure p21 induisent l’expression de la DPPIV fonctionnelle. Localisation a la membrane plasmique.

23. cki et expression de l’APN

24. cki et expression de l’APN

25. Conclusions • p27et dans une moindre mesure p21 induisent l’expression de l’APN.

26. En conclusion

27. Premier article montrant le rôle de p27 dans la différenciation des cellules epithéliales. Et en 2009? Même rôle dans les cellules épithéliales bronchiques Autres systèmes cellulaires...

28. In vivo…Il existe d’autres facteurs que les CKI. Souris KO pour P21… l’intestin est normal. Cancer: dans les carcinomes la P27 est souvent sous-exprimée. Cette sous expression est associée à une augmentation de l’agressivité des cancers.Mêmes résultats pour prostate et estomac. Comment peut on aller plus loin dans l'étude?

29. Pourquoi la surexpression de P21 induit la différenciation