MUTAZIONI NEI GENI STRUTTURALI III: il connettivo

1. MUTAZIONI NEI GENI STRUTTURALI III: il connettivo Lezione 6 By NA

2. Modello murino SONO QUINDI QUESTE MUTAZIONI A CAUSARE LA MALATTIA?? taglio con enzimi di restrizione e eliminazione di una parte della sequenza topo transgenico iniezione in un ovocita di topo fecondato sostituzione con un oligonucleotide sintetico con una mutazione ANALISI DI LINKAGE SU DIVERSE FAMIGLIE HANNO PERMESSO DI IDENTIFICARE DIVERSE MUTAZIONI IN GENI DEL COLLAGENE CHE SEGREGANO CON IL FENOTIPO OI. SE IL TOPO MANIFESTA LA MALATTIA ALLORA LA MUTAZIONE E’ LA CAUSA DELL’OI. By NA

3. Perche’ la patologia dominante E’ POSSIBILE RICONOSCERE MUTAZIONI PIU’ FREQUENTI PER CIASCUN TIPI DIVERSO DI OI a1 a2 a1 DEGRADATE MUTAZIONE IN UN ALLELE DEL GENE PER LA CATENA a1 Nonostante un solo allele del gene COL1A1 e’ mutato ben il 75% delle triple eliche sono anomale. La mutazione riguarda il 50% del prodotto genico, ma influenza il 75% della proteina..L’EFFETTO E’ DOMINANTE anche in caso di eterozigosi By NA

4. Relazione genotipo-fenotipo • GRAZIE A TALI STUDI MOLECOLARI E BIOCHIMICI E’ STATO POSSIBILE IDENTIFICARE MUTAZIONI NEI DIVERSI GENI DEL COLLAGENE CAUSA DELLE DIVERSE FORME DI OI • Mutazioni di grosse dimensioni(delezioni o inserzioni multiesoniche) sono rare perche’ compromettono la stabilita’ di gran parte delle molecole di collagene. Questo tipo di mutazioni si riscontra spesso in casi di OI di tipo II nelle forme letali in fase perinatale. • Piu’ frequenti sono le mutazioni puntiformi. Queste sono anche piu’ difficili da trovare viste le dimensioni della molecola del collagene. nei geni COL1A1 e COL1A2 sono state trovate numerose mutazioni che causano una sostituzione di una glicina con un altro amminoacido. A seconda del sito di sostituzione si manifestano diversi fenotipi OI. Questi ultimi sono piu’ gravi quando la sostituzione si verifica piu’ vicino all’estremita’ carbossi terminale. By NA

5. Relazione genotipo-fenotipo • Tutte le sostituzioni Gly-Asp sono risultate letali. • Mutazioni in siti di splicing possono provocare delezioni di esoni o splicing anomali con conseguente sintesi di molecole anomale di collagene. • Le mutazioni nel COL1A1 sono generalmente associate a fenotipi piu’ gravi rispetto a quelle che colpiscono il gene COL1A2 e i fenotipi piu’ gravi nel caso di mutazioni vicine all’estremita’ 3’ della tripla elica. L’APPROCCIO DI STUDI O DELL’OI E’ STATO QUELLO DELLA GENETICA DIRETTA IN CUI SI PARTE DA UN PRODOTTO PROTEICO PER ARRIVARE AL GENE E ALLO STUDIO DELLE MUTAZIONI AD ESSO ASSOCIATO • IN OGNI CASO IL PRIMO PASSO PER LO STUDIO DI QUALSIASI PATOLOGIA E’ L’ANALISI DEL FENOTIPO! By NA

6. Relazione genotipo-fenotipo riepilogo TIPO I: e’ causato da mutazioni nel COL1A1, in generale si tratta di mutazioni non senso (sostituzione di un codone di senso con un codone di stop) o mutazioni di splicing. Queste provocano una riduzione nella sintesi del collagene, ma le molecole che vengono sintetizzate hanno una struttura normale. TIPO II:e’ causato o da mutazioni multiesoniche(nei casi di forme letali) o da mutazioni missenso( sostituzione di un codone per un AA con uno per un AA diverso) che non comportano mancata produzione della proteina, ma produzione di catene a1(I)anomale. queste aggregandosi con catene normali portano alla formazione di triple eliche anomale causando il fenomeno dell’effetto dominante negativo. TIPO III: e’ una forma geneticamente eterogenea, si riscontrano mutazioni in geni diversi. A volte sono presenti anche piu’ mutazioni in geni diversi contemporaneamente. E’ l’unica forma per la quale e’ stata dimostrata anche trasmissione ditipo autosomico recessiva, frequente solo in alcune popolazioni come quella sud africana dove, pero’ di riconosce un EFFETTO DEL FONDATORE(prevalenza di un allele nella popolazione dovuta alla sua presenza in uno dei membri originari della popolazione stessa ed alla tendenza dei membri della popolazione ad accoppiarsi tra loro). In questo caso sono piu’ frequenti soggetti omozigoti per mutazioni in geni COL1A1 e COL1A2. TIPO IV: pur essendo generalmente lieve, puo’ presentare variazioni notevoli anche nella stessa famiglia(non e’ noto il perche’ di questa variabilita’). Si trovano frequentemente mutazioni puntiformi nei geni COL1A1 o COL1A2. By NA

7. Altre patologie associate a difetti del collagene LA SINDROME DI MARFAN E LA SINDROME DI EHLERS-DANLOS By NA

8. Sindrome di Marfan (MS) • INDEBOLIMENTO DEL TESSUTO CONNETTIVO. • Elevata statura e magrezza con braccia gambe e dita delle mani e dei piedi lunghe(aracnodattilia) • Ipersensibilita’ delle articolazioni e dislocazione • A volte dislocazione del cristallino per indebolimento del dei legamenti che lo sostengono e miopia. • Manifestazioni vascolari (prolasso della valvola mitriale nel 5% della popolazione generale e dilatazione del tratto iniziale dell’aorta che puo’ portare a aneurisma. Esistono diverse forme di espressione della MS: alcuni soggetti sono chiaramente affetti dall’infanzia, altri lo sono solo lievemente e anche il trattamento medico e’ variabile in conseguenza di cio’. By NA

9. Il gene della sindrome di Marfan ANALISI ISTOCHIMICHE ANALISI GENETICHE FIBRILLINA2: il gene mappa sul chr5, responsabile dell’aracnodattilia contratturale congenita FIBRILLINA1: il gene che la codifica mappa sul chr 15 Responsabile della MS • IL LOCUS MALATTIA E’ STATO MAPPATO SUL CROMOSOMA 15 Deficit della proteina extracellulare FIBRILLINA nei tessuti dei soggetti con MS Analisi di linkage con marcatori genetici casuali • La prova definita deriva dalla scoperta di mutazioni nel gene per la fibrillina in numerosi affetti dalla sindrome FIBRILLINA: glicoproteina del tessuto connettivo (componente delle microfibrille). Contiene 44 domini in tandem omologhi ad una sequenza del fattore di crescita dell’epidermide By NA

10. SSCP : Single Strand Conformational Polymorphism Omozigote Wild-type Eterozigote OmozigoteMutante PCR Denaturazione 1 2 3 Reverse Reverse Caricamento su gel Forward Forward A C C G G T A A C G T T A C C T G G A A C T G T G T A VARIAZIONI ANCHE DI 1 SOLA BASE PROVOCANO UNA DIFFERENZA NELLA CORSA SU GEL C Omo WT etero Omo mut Questo test si utilizza per identificare la variazione di una base senza dover ricorrere al sequenziamento. Si possono identificare il 70%-95% delle mutazioni di singola base in frammenti di lunghezza inferiore alle 200pb. By NA

11. Identificazione delle mutazioni della fibrillina Omozigote Wild-type Eterozigote SM PCR SSCP : Single Strand Conformational Polymorphism N N MS N By NA

12. Relazione genotipo-fenotipo in MS FENOTIPO CLINICO LIEVE FENOTIPO CLINICO PIU’ GRAVE FENOTIPO CLINICO MEDIO O GRAVE fenotipo piu’ grave se viene compromesso l’assemblaggio NON SI SA QUALE SIA LA CAUSA DELLA MS • Tipo I: riduzione del 50% nella sintesi della fibrillina, ma quella presente nella matrice e’ normale. MUTAZIONI NON SENSO (solo l’allele wild-type da’ origine alla proteina normale) • Tipo II: riduzione della sintesi e secrezione della proteina. MUTAZIONI MISSENSO (viene prodotta una certa quantita’ di proteina anomala che interagisce con la proteina normale).DOMINANTE NEGATIVO • Tipo III e IV: normale livello di sintesi, ma moderata o grave riduzione della secrezione nella matrice extracellulare della fibrillina • Tipo V: i livelli di proteina sintetizzata e secreta sono normali By NA

13. Sindrome di Ehlers-Danlos interessano principalmente cute e articolazioni. sono state trovate mutazioni nel collagene di tipo V (mutazioni in COL5A1 o COL5A2). • Tipo I : piu’ grave • tipo II: piu’ lieve • Ipersensibilita’ delle articolazioni • Iperplasticita’ della cute. • Sono dovuti a mutazioni in locus diversi • Esistono diversi tipi Vengono ereditati con modalita’ diverse. DOMINANTI • TIPO IV vascolare : pelle traslucida con vene chiaramente visibili e facilmente escoriabile. Minima ipersensibilita’ delle articolazioni. Gravi rischi di rottura di arterie, del colon e utero. Attesa di vita non superiore ai 50 anni. E’ causata da mutazioni nel gene COL3A1 che codifica per le catene di tipo III (mancata produzione del collagene di tipo III) di cui sono particolarmente ricche le pareti arteriose, dell’intestino e utero. By NA

14. Sindrome di Ehlers-Danlos • Ipersensibilita’ delle articolazioni • Iperplasticita’ della cute. RECESSIVE • TIPO VI:cute soffice e iperelasticita’, ipersensibilita’ delle articolazioni e fragilita’ oculare (distacco della retina). Autosomica recessiva, causata da mutazioni nel gene per la lisil idrossilasi responsabile delle modifiche post traduzionali del collagene. • TIPO VII: dislocazione congenita delle anche e altre articolazioni ed estrema ipersensibilita’ articolare. Autosomica recessiva causata da mutazioni nel gene per la Procollagene peptidasi responsabile del processamento extracellulare del collagene • TIPO IX: RECESSIVA X-LINKEDcute lassa, diverticoli e rottura della vescica e deformita’ scheletriche. Colpisce gravemente i soggetti di sesso maschile. E’ causata da un difetto del metabolismo del rame. ( L’attivita’ della lisil idrossilasi e’ coadiuvata dal rame) By NA

15. Diagnosi e trattamento delle malattie del tessuto connetivo • UNA DIAGNOSI ATTENTA PUO’ AIUTARE A COMPRENDERE IL POSSIBILE DECORSO DELLA MALATTIA E IDENTIFICARE I RISCHI FUTURI (e’ importante fare attenzione a tutti i piu’ piccoli segni che possano aiutare a inquadrare correttamente la patologia, capire la storia della famiglia, come la malattia si trasmette e considerare i fattori che possono modificare i rischi di trasmissione). • ATTENTA INFORMAZIONE DELLE FAMIGLIE DEI RISCHI DELLA MALATTIA: spesso il medico deve attenersi alla volonta’ del paziente nonostante in alcuni casi la diagnosi possa riguardare anche altri membri della famiglia (come nel caso della MS). • PREVENZIONE DEI FATTORI CHE POSSONO COMPLICARE O AGGRAVARE LA MALATTIA: evitare attivita’ che potrebbero provocare fratture o traumi nel caso dell’OI. By NA

16. Diagnosi e trattamento delle malattie del tessuto connetivo • PREVENZIONE DEI FATTORI CHE POSSONO COMPLICARE O AGGRAVARE LA MALATTIA: evitare attivita’ che potrebbero provocare fratture o traumi nel caso dell’OI. • USO DI COMPOSTI CHE MIGLIORINO IL RIASSORBIMENTO OSSEO DA PARTE NELLE OSTEOCLASTI O INTEGRAZIONE DELLA DIETA CON CALCIO E VITAMINA C (Cofattore di uno degli enzimi responsabile della formazione dei legami crociati del collagene) • IL CONSULENTE GENETICO NON HA SOLO IL COMPITO DI CALCOLARE I RISCHI O DISCUTERE UNA DIAGNOSI PRENATALE , MA COMINCIA DALLA DIAGNOSI PER POI COMPRENDERE L’INFORMAZIONE SULLA STORIA NATURALE DELLA PATOLOGIA E SULLE POSSIBILITA’ DI AZIONE SU ESSA. LA SUA ATTIVITA’ COADIUVA QUELLA DEL MEDICO PER UN CORRETTO TRATTAMENTO. By NA