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TECNICAS GENÉTICAS

TECNICAS GENÉTICAS. Detección de microorganismos directamente en muestras clínicas identificando un fragmento específico del genoma del microorganismo concreto Identificación del microorganismo tras su aislamiento por métodos convencionales

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TECNICAS GENÉTICAS

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  1. TECNICAS GENÉTICAS

  2. Detección de microorganismos directamente en muestras clínicas identificando un fragmento específico del genoma del microorganismo concreto • Identificación del microorganismo tras su aislamiento por métodos convencionales • Cuantificación del número de virus presentes en una muestra de sangre o suero (carga vírica) • Detección de factores de virulencia • Determinación de resistencia a antibióticos directamente en muestra o sobre cultivo • Estudios epidemiológicos: comparación cepas aisladas

  3. TÉCNICAS • Muchas. Variantes de las preexistentes o nuevas • Clasificación: • Técnicas de hibridación • Técnicas de amplificación

  4. PREMISAS • Primer paso: extracción de los ácidos nucleicos • Lisis celular • Concentración del ácido nucleico • Protección frente a la degradación enzimática • Eliminación de inhibidores de las reacciones que se vayan a realizar • Métodos • Físicos: sonicación, congelación/descongelación… • Químicos: • Proteinasa K + Fenol-cloroformo, Tiocianado de guanidina… • Enzimáticos: lisozima…

  5. PREMISAS • Desnaturalización: cuando se calienta ADN por enciam de 90ºC las 2 cadenas se separan. Al descender la temperatura las basses vuelven a aparearse reconstituyendo el ADN original • Sonda: pequeños fragmentos de ADN (20-50 nucleotidos) sintetizados en el laboratorio y cuya secuencia es complementaria de la de un fragmento genético, en este caso el que queremos detectar

  6. HIBRIDACIÓN • Unión de la sonda con su secuencia complementaria. Muy específica • Detección: sondas marcadas • Sustancia radiactiva • Fluorescente • Enzima • Acs marcadas frente a ADN bicatenario • …

  7. HIBRIDACIÓN

  8. HIBRIDACIÓN • Formatos • En solución • Soporte o fase sólida • INNO-LIPA • In situ

  9. HIBRIDACIÓN

  10. ADN complementario Sonda Soporte Hibridación HIBRIDACIÓN Sustrato Sustrato coloreado

  11. TECNOLOGÍA DE LOS CHIPS O DE LOS “ARRAYS”

  12. TÉCNICAS DE AMPLIFICACIÓN

  13. TÉCNICAS DE AMPLIFICACIÓN • Hibridación directa: baja sensibilidad • Paso previo: amplificación • Clonación in vitro que permite obtener múltiples copias de un fragmento de: • ADN • ARN: tras conversión en ADN complementario (ADNc) mediante un transcriptasa inversa

  14. TÉCNICAS • PCR • Nested-PCR • PCR múltiple • PCR cuantitativa • PCR a tiempo real • Amplificación basada en la transcripción • Otras técnicas que no amplifican una secuencia diana

  15. PCR • Se amplifica una secuencia diana espedífica de un microorganismo concreto utilizando una polimerasa y cambios de temperatura

  16. REACCIÓN EN CADENA DE LA POLIMERASA (PCR) • Elementos químicos • ADN problema • Primers o iniciadores • dNTPs • Polimerasa • Iones.... • Elementos físicos • Temperatura • Desnaturalixación • Apareamiento • Síntesis o extensión ADN?IniciadoresPolimerasadNTPsIones...

  17. Desnaturalización Apareamiento Extensión

  18. NESTED-PCR • Amplificación de un fragmento • Reamplificación de un fragmento interno con otros cebadores • En 1 tubo (diferentes temperaturas) o en 2 tubos

  19. PCR MÚLTIPLE • Muestra extraida + varios juegos de cebadores Amplificación de diferentes dianas Ej.: identificación + determinantes de resistencia

  20. PCR CUANTITATIVA • Determinar el número de copias de la muestra inicial • Suele utilizarse una técnica competitiva Cantidad conocida ADN ó ARN problema ADN ó ARN competidor + • Mismos cebadores • Igual longitud amplificados • Mismas condiciones Cantidad Cantidad Ci Ci = Relación lineal Cf Cf

  21. PCR A TIEMPO REAL • Realización en muy poco tiempo (aprox. 30´) • Cuantificación continua y precisa del ADN que se va formando Igual que PCR convencional pero modificaciones técnicas • Capilar: cambios de temperatura muy rápidos • Fragméntos amplificados muy cortos • Termociclador y lector específicos • Diferentes métodos de detección

  22. AMPLIFICACIÓN BASADA EN LA TRANSCRIPCIÓN • Variedades: NASBA, TMA, 3SR… OTRAS TÉCNICAS QUE NO AMPLIFICAN SECUENCIAS DIANA • Amplificación de las sondas una vez que estas han hibridado con sus dianas • LCR (Ligase Chain Reaction) • Ligar y amplificar los cebadores • Q-replicasa: no comercializada

  23. Dco indirecto + Conocido ? REACCIONES ANTÍGENO/ANTICUERPO • Estrategias de laboratorio que permiten detectar que una reacción Ag-Ac ha tenido lugar • Base fundamental: especificidad de la reacción + Dco directo ? Conocido

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