Lésions d’ischémie reperfusion : le cauchemar du transplanteur

1. Lésions d’ischémie reperfusion : le cauchemar du transplanteur

2. Principaux mécanismes lésionnels au cours de l’ischémie reperfusion Ischémie froide Reperfusion Lésions d’hypoxie Lésions chroniques Réaction inflammatoire Lésions liées à la réoxygénation Lésions d’hypothermie Lésions liées au réchauffement/ Apoptose induite par la conservation T Hauet

3. En cas de DDAC : des lésions en 3 temps… Ischémie Hypothermie Revascularisation

4. Effet à long terme Lésions d’ischémie reperfusion : Conséquences cliniques Ni RRF ni RA RA RRF RRF + RA Effet respectif de la reprise retardée de fonction et du rejet aigu (Tx rénale)

5. Rôle central de la mitochondrie • Chaque jour un adulte utilise (et recycle) une quantité d'ATP équivalente à 75 % de son poids corporel ! • Dans les conditions de repos, un tiers est utilisé pour le fonctionnement des pompes membranaires comme les ATPases

6. membrane externe espace intermembranaire membrane interne Mitochondrie matrice H+ H+ H+ H+ H+ CoQH2 réactions d ’oxydo- réduction: transfert d ’e- III I II IV F0 CoQ ADP + Pi F1 NaD+ FAD NaDH,H+ FADH2 1/2 O2 ATP H2O La phosphorylation oxydative

7. Acidose lactate pyruvate glucose acétyl CoA cycle de Krebs Ischémie = arrêt de la phosphorylation oxydative ATP NADH, H+ glycolyse - O2 +O2 NADH, H+ FADH2

8. Le bilan énergétique n’est pas brillant… 1 mole de glucose Métabolisme aérobie Métabolisme anaérobie 38 moles d’ATP 2 moles d’ATP 2 mol. d’a lactique

9. O2°- H2O2 OH° e- e- e- Il existe une production radicalaire physiologique au niveau mitochondrial 3 à 5% Monoréduction physiologique O2 h 1O2 4 e- Tetraréduction H2O 95% O2°- = anion superoxyde OH °= radical hydroxyle H2O2= peroxyde d ’hydrogène 1O2= oxygène singulet

10. Un radical libre(RL)est constitué par tout atome, groupe d’atomes ou molécules où au moins un électron non apparié occupe une orbitale externe [•] Le radical s’en trouve doté d’une réactivité particulière et peut ainsi réagir avec d’autres atomes ou molécules et se comporter, selon le cas, comme un oxydant ou comme un réducteur, afin d’apparier son électron célibataire Radical libre… de nuire ! Bref, c’est la patate chaude… Qu’est-ce qu’un radical libre ? B Barrou, T Hauet EFPMO Juin 2009

11. Conséquences de l’ischémie : la lecture biochimique Privation d’O² et nutriments Accumulation de déchets ischémie Inhibition du métabolisme oxydatif Déplétion en ATP Glycolyse anaérobie hypoxanthine Inhibition pompes Na/K Instabilité lysosomale Acide Lactique Pertes électrolytes Œdème intraCel. Libération Enzymes lytiques Ph ↓ • Activité protéases et phospholipases Ouv canaux Ca++  Ca++ cytosol Production radicaux libres Altération cytosquelette, protéines Peroxydation lipides membranaires

12. Le paradoxe de la reperfusion Ischémie Reperfusion

13. Syndrome de reperfusion X 100 Perico N, Lancet 2004, 364: 1814-1827

14. Conséquences immunologiques de l’IRI

15. Conséquences de l’ischémie : la lecture immunologique ischémie lésions tissulaires Ligands endogènes des TLR La costimulation indispensable provient de l’ischémie via la voie des TLR • Immunité innée Engagement TLR sur DC Maturation DC • CD80 CD86 sur DC Alloantigène Migration DC vers OL II Activation des LT naifs Ag spécifique  Alloreconnaissance Evènements Ag dépendants, spécifiques Evènements Ag indépendants, non spécifiques

16. Théorie du signal dangerversion chirurgicale Alloreconnaissance + inflammation Alloreconnaissance

17. Ligands endogènes des TLR : les «DAMPs»damage associated molecular pattern molecules • TLRs, including TLR2 and TLR4, could function as: • detectors of sterile (not pathogen-associated) injury upon binding to endogenous ligands released by damaged cells • damage-associated molecular patterns, (DAMPs). • Examples of putative endogenous ligands • heat-shock proteins, • high-mobility group box 1 (HMGB1), • heparan sulfate, • hyaluronan fragments, • fibronectin . • Is it true in the clinical setting ?

18. TLR4 Expression Human kidney biopsy before reperfusion Cold isch: 0.5 h (n=15) Cold isch: 20 h (n=9) • TLR4 is expressed in normal human kidneys • TLR4 is significantly upregulated by ischemic injury Krüger et al. Blood 2009

19. HMGB1 expression in implantation biopsies Krüger et al. Blood 2009 LD = living donor, DD = deceased donor

20. HMGB1-induced TLR4-mediated inflammation Krüger et al. Blood 2009 rHMGB1 stim Proximal tubular cell line (HK-2) cultured without (Unstim) or with the TLR4-specific ligand LPS (1 μg/ml) or with rHMGB1 (5 μg/ml)

21. TLR2 Expression: kidney >> Leukocytes Kidney TLR-2-/- Leukocytes TLR-2-/- Leemans /Florquin et al. J Clin Invest. 2005

22. TLR4 Expression: kidney >> Leukocytes Kidney: WT, leuco: KO Kidney: KO, leuco: WT Huiling Wu et al. J Clin Invest. 2007

23. Differences between organs TLR4 dependent liver ischaemia reperfusion injury Zhai et al. J. Immunol. 2004

24. Principes de conservation • Conserver en hypothermie : • Loi de Van’t Hoff :  activité enzymatique de 50% par pallier de 10°C • 10 à 12 % du métabolisme persiste à 4°C • Limiter l’œdème intracellulaire : • Imperméants : qui « imperméabilisent » la membrane • Colloïdes :  pression oncotique dans compartiment vasculaire • Limiter la perte énergétique (stock en ATP) : • Composition extracellulaire des solutions • Prévenir l’acidose intracellulaire… mais pas trop : • Sévère : activation phospholipases, protéases • Modérée (6.9 – 7) : inhibition fructokinase  glycolyse • Prévenir les lésions oxydatives des radicaux libres : • Chélation ? La plupart sont produits lors de la reperfusion… • Développer la préservation dynamique • Immunomasquage : Théorie du signal danger (Polly Matzinger)

25. Solution intra ou extra cellulaire ? Na+ Na+ K+ K+ Niveau ATP En ischémie :  lésions des membranes •  02 •  ATP   de l’activité des pompes

26. Laboratoire de RMN - Physiologie - Cryobiologie- Michel EUGENE 31P Magnetic Resonance Spectroscopy of Isolated perfused rat kidney(37°C + continuous perfusion 95%O2 5% CO2) Effect of depolarizing (high K+) solutions ATP (%) low K+ 120 100 80 Krebs - PEG 30 g/L high K+ 60 40 Eurocollins 20 U W 0 C 1 2 3 4 5 6 7 8 time (h) Bauza G, Hauet T, Eugene M

27. Comment limiter ces lésions ?Les solutions de préservation • Composition extracellulaire : K+ bas • Lutter contre le spasme Effects of elevation in external K+ concentration on contractile force and membrane potential in rabbit MCA Gokina et al Am.J Physiol Heart Circ.Physiol 278:H2105-H2114, 2000 M Eugène

28. activité Na-K ATPase  entrée passive Na+  œdème cellulaire Imperméants Colloides Agissent au niveau interstitium et mbe Anions non saccharidiques saccharides • Gluconate • Citrate • Lactobionate • tous chargés négativement • Agissent par propriétés électro-chimiques • Glucose (monoS de PM 180) : abandonné car produisant des lactates  Eurocollins • Mannitol (monoS de PM 182) : propriétés anti-oxydantes  Marshall’s, HTK, celsior • Sucrose (diS de PM 342)  PBS • Raffinose (triS de PM 504)  UW

29. Imperméants Colloides Agissent au niveau du compartiment vasculaire  activité Na-K ATPase  entrée passive Na+  œdème cellulaire • HES (amidon)  UW • PM > 106 daltons •  viscosité, agrégation GR • Dextran : • PEG : SCOT 15, IGL1 • différentes longueurs de chaine • immunomasquage

30. L’avenir : la préservation normothermique ? • Eviter l’hypothermie, qui a des effets délétères en elle-même • Dissocier les paradoxes de la réadministration d’O2 de l’effet cataclysmique des leucocytes lors de la reperfusion • Par une solution acellulaire capable de transporter l’O2 • Restauration de la phosphorylation oxydative • Induction de mécanismes de réparations des lésions d’ischémie • Avant la seconde claque de la reperfusion • En dehors de toute inflammation et de toute infiltration du greffon par les leucocytes • Induction de facteurs susceptibles d’induire des phénomènes de réparation cellulaire et de prévenir les lésions de reperfusion : • Hème Oxygénase I • HSP 70 • …

31. Place respective des différentes modalités… Viaspan, statique, 4° Mox 100, viaspan, 4° Perfusion pulsatile 32°, EMS + Hb bov + 02 Modèle d’autotransplantation chez le chien, sans ischémie chaude initiale Brasile L, AJT 2003, 3: 674-9

32. Conclusion • Une bonne greffe commence par une bonne préservation • L’ischémie froide doit rester la plus courte possible • Les chirurgiens doivent connaître les lésions d’IR et les différentes solutions de préservation • La préservation sur machine pour les reins va concerner 1/3 à la 1/2 des greffons • Nombreuses perspectives de réanimation ex vivo des greffons • Laboratoires de perfusion ?