Antigenní mapping v nemolekulární diagnostice epidermolysis bullosa congenita

1. Antigenní mapping v nemolekulární diagnostice epidermolysis bullosa congenita M.Jarošová, A. Mišurcová, M.Vávrová, D. StříteckáI.patologicko-anatomický ústavFN u sv. Anny, Brno Rožnov pod Radhoštěm, 2007

2. Žít s epidermolysis bullosa znamená… … mít kůži tenkou, křehkou a lehce zranitelnou, jako jsou motýlí křídla. … vědět, že stačí tlak, tření švu prádla, které způsobí bolavé poranění a puchýře na kůži. … že při polknutí tuhé stravy mohou být poraněny sliznice v dutině ústní, což znemožní polknout třeba vlastní sliny … mít puchýře na chodidlech už po deseti či patnáctiminutové chůzi. … vyřazení z většiny dětských her, protože i obyčejné hračky mohou neobyčejně ublížit. … denně trávit až tři hodiny ošetřováním poraněné kůže, bolestivých ložisek. … vyvazovat prsty na rukou, aby se oddálil jejich srůst.

3. Epidermolysis bullosa congenita (EBC) • EB je velice vzácné onemocnění kůže • Každý z nás může být nosičem vadného genu • V současné době neexistuje žádný způsob léčby • Jedná se o onemocnění genetické, ne nakažlivé, nepostihuje intelekt • Největší nadějí je genová terapie • Těžká forma může skončit smrtí pacienta v raném věku • Poraněná kůže je velmi citlivá a rány (defekty) neustále bolí. Dochází k řídnutí a vypadávání vlasů a ke ztrátě nehtů a zubů

4. Epidermolysis bullosa congenita (EBC) • Tvorba puchýřů na kůži, někdy i na sliznicích • Po drobných traumatech (tření, tlak) nebo i spontánně - mechanobulózní dermatózy • Při postižení sliznic nelze pak polknout ani sliny, sousto jídla, tvoří se puchýře v GIT a dýchacím systému • Typické pro EBC – projevy onemocnění se mohou lišit i v rámci jedné rodiny • Rozlišujeme tři formy – simplex, junkční a dystrofickou, z nichž každá má několik podtypů

5. Epidermolysis bullosa congenita (EBC) • EB SIMPLEX→rovina štěpení epidermální -uvnitř epidermis jako následek cytolýzy • Je nejběžnější forma onemocnění • Puchýře a rány na rukou a nohou • Je popsána jako nejslabší, neboť kůže nezjizví, ale není možné podceňovat každodenní bolest a omezení

6. Epidermolysis bullosa congenita (EBC) • EB JUNKČNÍ (ATROFICKÁ ) → štěpení uvnitř lamina lucida (v oblasti dermoepidermální junkce) • Junkční forma EB má několik podtypů, které se liší svou závažností • Bývají postiženy i průdušky a hrtan • Těžký typ junkční formy EB obvykle končí smrtí dítěte během prvních měsíců života

7. Epidermolysis bullosa congenita (EBC) • EB DYSTROFICKÁ →dochází ke štěpení těsněpod lamina densa v oblasti kotvících fibril (subepidermálně) • Dystrofická forma EB může mít různé projevy • Patří mezi nejzávažnější a velice omezuje běžný život člověka

8. Epidermolysis bullosa congenita (EBC) - terapie • Obecně - antiseptika, lokální antibiotika, krytí, zvláčňující krémy, pohodlná obuv, minimum švů, volné bavlněné prádlo • EBS – v rodinách vlastní zkušenosti, jak předejít provokujícím vlivům, autosomálně dominantní dědičnost, rodiče předávají dětem vlastní specifické způsoby terapie • EBJ – obecné zásady lokální terapie stejné jako u ostatních, generalizované formy onemocnění se ošetřují snadněji než EBD

9. Epidermolysis bullosa congenita (EBC) - terapie • EBD– nejnáročnější péče, zahrnuje péči o kůži, prevenci a léčbu komplikací např. • Srůsty prstů → existuje možnost operace - plastická chirurgie – odseparování • Poranění sliznice GIT → tekutá a kašovitá strava • Infekce v dutině ústní → kazivost chrupu, poškozené dásně • Sideropenické anémie → ztráta Fe vlivem krvácení aj.

10. Epidermolysis bullosa congenita (EBC) dystrofická simplex junkční

11. Epidermolysis bullosa congenita (EBC) – materiál a metody • Biopsie kůže pacienta provedena raznicí (punch biopsy) velikosti asi 4 mm • Vzorek ihned po dodání ve vlhké komůrce zmražen v propanu chlazeném tekutým dusíkem a uchován v suchém ledu v mrazničce

12. Epidermolysis bullosa congenita (EBC) – materiál a metody • Zhotoveny kryostatové řezy • Metodou nepřímé IMF lze prokázat antigenní komponenty v oblasti dermoepidermální junkce • Inkubace s normálním sérem • Inkubace s primární neznačenou Ab • Inkubace se sekundární Ab konjugovanou s fluoresceinem (FITC) • Hodnocení vždy s pozitivní a negativní kontrolou ve fluorescenčním mikroskopu, dokumentace každého případu pacient kontroly

13. Epidermolysis bullosa congenita (EBC) – materiál a metody • Inkubace s normálním sérem zvířete, ze kterého je získána sekundární značená protilátka • Například jestliže použijeme jako sekundární protilátku - koza anti králík IgG - FITC, zvolíme normální kozí sérum k blokaci nespecifických vazeb • Inkubace probíhá 20 minut ve vlhké komoře Anti králík IgG FITC

14. Epidermolysis bullosa congenita (EBC) – materiál a metody • Inkubace s primární protilátkou ředěnou pufrem TRIS/HCl, pH 7,2 – 7,4 • Použita myší, krysí a kozí primární protilátka • Čas a konkrétní ředění je uvedeno v tabulce • Při použití vlhké komory jsme inkubovali za pokojové teploty

15. Epidermolysis bullosa congenita (EBC) – materiál a metody

16. Epidermolysis bullosa congenita (EBC) – materiál a metody Ig G FITC • Inkubace se sekundární protilátkou konjugovanou s FITC • Pro krysí primární protilátku používáme koza anti- krysa IgG-FITC • Pro kozí primární protilátky používáme osel anti-koza IgG-FITC • Pro myší primární protilátky koza anti-myš IgG-FITC • Ředěno pufrem TRIS/HCl pH 7,2 – 7,4 • Inkubace ve vlhké komoře za pokojové teploty Kozí primární protilátka Krysí a myší primární protilátka Ig G FITC

17. Epidermolysis bullosa congenita (EBC) – materiál a metody

18. Epidermolysis bullosa congenita (EBC) – materiál a metody • Důkladný oplach destilovanou vodou • Zamontování do DAPI – fluorochrom, váže se na DNA, RNA • Hotové preparáty lze uchovávat v lednici, dle našich zkušeností i po měsíci lze ještě prohlížet Jádra buněk označena DAPI

19. Epidermolysis bullosa congenita (EBC) l Kolagen VII Laminin 5 CK 5, CK 14

20. Epidermolysis bullosa simplex • snížená nebo chybějící reakce s PL proti CK5 a CK14, mutace v genech pro CK5 nebo CK14 • BPAg 1, BPAg 2, laminin 5, kolagen IV v bázi puchýře, nezměněné pozitivní reakce • drobné zbytky bazálních keratinocytů jsou prokazatelně i v bázi puchýře, lze dokázat protilátkami Anti-CK MNF 116 (obsahuje keratiny 5, 6, 8, 18) a Anti-CK HMW (high molecular weight, CK 1, 5, 10, 14)

21. Epidermolysis bullosa simplex Pacient, CK 5, fragmenty bazálních keratinocytů Pozitivní kontrola, CK 5

22. Epidermolysis bullosa junkční • kolagen IV, kolagen VII v bázi puchýře, pozitivní nezměněná reakce • BPAg 1, CK 1, 5, 10, 14 nezměněná pozitivní reakce • reakce s lamininem 5 (GB3) je zeslabena nebo chybí úplně, mutace v genu pro laminin 5 • BPAg 2 ve stropu puchýře

23. Epidermolysis bullosa junkční Pozitivní kontrola Laminin 5 Pacient, EBJ, Laminin 5 chybí

24. Epidermolysis bullosa junkční Pacient, kolagen VII v bázi puchýře Pacient, BPAg 2 ve stropu puchýře

25. Epidermolysis bullosa junkční Pacient, junkční puchýř, BPAg1 Pacient, kolagen IV v bázi puchýře

26. Epidermolysis bullosa dystrofická • EBD - snížená nebo chybějící rekce s PL anti-kolagenVII, mutace v genu pro kolagen VII (COL7A1) • všechny Ag (antigeny) keratinocytů a Ag lamina lucida (laminin 5 (GB3), α6β4 integrin) pozitívní nezměněná reakce • Kolagen IV (lamina basalis), BPAg1, laminin 5 ve stropu puchýře

27. Epidermolysis bullosa dystrofická Pacient EBD Chybí kolagen VII Pozitivní kontrola Kolagen VII

28. Epidermolysis bullosa congenita (EBC) Antigenní mapování slouží k navedení molekulárně-genetické laboratoře ve vyšetřování genetických změn a přesnější subtypizaci onemocnění

29. ZDROJE INFORMACÍ • Buček, J., Bučková, H., Epidermolysis bullosa congenita, IDVPZ, Brno, 2000 • Internetové stránky organizace DEBRAwww.debra-cz.org • Internetové stránky Univerzity Groningen, http://dissertations.ub.rug.nl/faculties/medicine/2006/a.m.g.pasmooij/ • Weedon, D.: Skin Pathology. Churchill, Livingstone, Edinburgh, 1997, s. 17-28 • J.D. Fine, L.T.: Smith,Nonmolecular Diagnostic Testing of Inherited Epidermolysis Bullosa. chapter 3, s.60-73

30. Děkujeme za pozornost