NAGYHATÉKONYSÁGÚ FOLYADÉKKROMA-TOGRÁFIA = NAGYNYOMÁSÚ = HPLC

1. NAGYHATÉKONYSÁGÚ FOLYADÉKKROMA-TOGRÁFIA = NAGYNYOMÁSÚ = HPLC Az alkalmazott nagy nyomás (100-1000 bar) lehetővé teszi nagyon finom szemcsézetű töltetek (2-10 μm) használatát, ami jelentősen megnöveli a módszer felbontóképességét. A hagyományos oszloptechnikánál gyorsabb (kényszer áramlás), pontosabb és folyamatosan detektálható. A gázkromatográfiával szemben hőre érzékeny- és nem illó vegyületek esetében is használható. A mozgófázissal szelektív kölcsönhatások alakulnak ki.

2. HPLC FELÉPÍTÉSE

3. Ő építette meg az első nagynyomású folyadékkromatográfot. Bár a szakirodalmi adatok szerint J. C. Giddings, Joseph F. K. Huber és Horváth Csaba egyaránt jelentős szerepet vállaltak - egymástól függetlenül - a HPLC kifejlesz-tésében és elterjesztésében, a HPLC atyjának mégis egyértelműen Hor-váth Csaba professzort ismeri el a szakma, mivel elsőként ő ismerte fel a HPLC egyedülálló jelentőségét a biokémia, a molekuláris biológia és a modern bioanalitika területein. A legelismertebb, az RP-HPLC-t meg-alapozó elméleti közleményére csak-nem ezer citálást kapott, ez az elvá-lasztástudomány legtöbbször idézett munkája. Horváth Csaba 1930-2004

4. OLDÓSZEREK • Üveg, vagy műanyag edények. • Megfelelő tisztaság (oszlop védelme és a megfelelő detektálás érdekében!). • Gázmentes. Eluensben oldott gázok és főleg az O2 eltá-volítása. Zavarja a pumpa egyenletes működését és a detektorban kis csúcsokat produkál. • Gázmentesítés megvalósítása: • - melegítés; • - vákuum alkalmazása; • - ultrahangos szonikálás (rázatás); • - sparge = He gáz átbuborékoltatása folyamatosan (oldott gázokat kiűzi). • Szűrés – üvegszűrő + vákuum alkalmazása.

5. SZIVATTYÚK • Feladatuk: egyenletes, szabályozott folyadékáramlás • Mechanikus szivattyúk – állandó áramlási sebesség biztosítása. Két egymással szemben működtetett váltakozó mozgásirányú dugattyús szivattyúk (reciprok pumpák). • Pulzáláscsillapító

7. Pulzáláscsillapító 1, tekercs - flexibilis 2, membrán – hexánnal töltve 1 2

8. Szivattyú után nagynyomású szűrő következik (2 μm-es saválló acél). • Nyomásmérő (jelzi, ha az oszlop eltömődik, vagy a szivattyú hibás). • Összekötő csövek: saválló acél, vagy speciális műanyag 0,2-0,3 mm belső átmérővel. Minél rövidebb utak → kis holttérfogat (keverőedény effektus). GRADIENSKÉPZŐ • Izokratikus elúció – változatlan összetételű mozgófázis • Gradiens elúció – az eluens összetételének folyamatos (lineáris, exponenciális, vagy parabolikus), vagy ugrás-szerű változtatása. • Alacsony nyomású keverő – pumpa előtti keverés • Nagy nyomású keverő – pumpa után, oszlop előtti keverés

10. Mintainjektáló rendszer • Injektált mennyiség (analitikai): 5-100 μl • Fajtái: • Injektálószelep - Rheodyne, cserélhető rögzített térfogatú hurkokkal (loop). • Automata mintaadagoló Programozható mintamennyiség – motorizált fecskendő. Automatizált mérés (100 mérés/éjszaka).

11. Kézi injektálás

12. Automata mintaadagoló

13. OSZLOP • Anyaga: saválló acél, vagy műanyag. • 10 – 30 cm hosszú, d = 2-6 mm. • Analitikai oszlop védelmének érdekében előtét oszlopot használunk (védő oszlop = guard column), mely azonos töltetű, mint az analitikai oszlop (1-5 cm). • Töltetek szemcsemérete 2-10 μm, nagy fajlagos felület > 100 m2/g, nagy kapacitás és kellő szilárdság. • Hatékonyan elválasztó oszlopot csak egyenletes kisátmé-rőjű, gömb alakú szemcsékből lehet készíteni. • Minél kisebb a szemcseméret, annál nagyobb N (nagyobb a fajlagos felület), csökkentésének határt szab a növekvő nyomás, amit a megnövekedett oszlopellenállás produkál (sugárirányú hőmérséklet gradiens).

15. van Deemter görbék különböző szemcseméretű állófázisok esetén Áramlási sebesség ml/min

16. NORMÁL FÁZISÚ FOLYADÉKKROMATOGRÁFIA • Állófázis: poláris, mechanikailag stabil. • Szilikagél • Aluminium-oxid • Módosított szilikagél. Porózus anyagok. Szilikagélek átlagos pórus átmérője 6-20 nm (pl. 120 Å), ez 500-1000-red része a szemcseméretnek. Víz dezaktiválja a felületet. Fémszennyezések kerülése.

17. Szabad szilanol csoport (gyenge sav) • Módosítot szilikagél Szubsztituált klórszilánnal módosítják. Felvitt csoportok: fenil, amino, diol, ciano. Poláris (dipol-dipol, dipol-indukált dipol) kölcsönhatás a vegyületek és az állófázis poláris csoportjai között (-OH, -NH2, -CN), ami retencióhoz vezet. Minél polárisabb egy vegyület, annál tovább tartózkodik az állófázisban, annál nagyobb retenciós ideje lesz.

18. Módosítot szilikagél

19. Mozgófázis • Apolárisabb, mint az állófázis (lsd. Eluotróp sorok). Oldószererősség. Minél apolárisabb egy oldószer annál kisebb az oldószererőssége, vagyis a visszatartás (retenciós idő) nagy. Általában szénhidrogének alkotják a mozgófá-zist, ehhez adunk 0,1-20 V/V% poláris oldószert, módosítót (pl. éter, észter, alkohol). Oszlop nyomása Δp = Lμηφ dp2 L = oszlop hossza μ = áramlási sebesség η = viszkozítás φ = az oszlop porozitására jellemző tag dp = átlagos szemcseméret

20. ALKALMAZÁSA • Apoláris, vagy közepesen poláris izomer vegyületek elválasztása (szénhidrogénekben jól oldódjanak). • Sztereoizomerek elválasztása – királis állófázissal • Félpreparatív elválasztás – szerkezetazonosításra (hosszabb és nagyobb átmérőjű oszlopok)

22. FORDÍTOTT FÁZISÚ FOLYADÉKKROMATOGRÁFIA • Mozgófázis polárisabb, mint az állófázis • Módosított szilikagél • Szerves polimer alapú állófázisok • Szén alapú állófázisok

23. Savas hidrolízis helye OH OH CH3 CH3 Si Si Si OH Cl Si O + C18H37 C18H37 -HCl CH3 CH3 OH OH Szabad szilanol csoport Szilikagélt aklilcsoportokat tartalmazó klórszilánnal reagáltatjuk (mono-, di- és triklór-szilánnal).

24. monomer polimer Monofunkciós- és bifunkciós (pl. diklór-szilánnal) módosítás

25. A módosítás során a szilanolcsoportok 40-60%-a reagálat-lan marad. • Utóreakció során trimetil-klórszilánnal módosítanak. Endcapping = utóreakció (e) • Használhatóság pH tartománya: 2 (alkil csoportok savas hidrolízise) < pH < 8-9 (szilikagél kioldódása). Újfajta oszlopok: pH = 10-11 • Apoláris (diszperziós) kölcsönhatás a vegyületek és az állófázis apoláris csoportjai között (C4, C8, C18), ami retencióhoz vezet. • Minél apolárisabb egy vegyület, annál tovább tartózkodik az állófázisban, annál nagyobb retenciós ideje lesz.

27. Mozgófázis • Poláris, kis viszkozitású, jó UV áteresztőképességű, kevéssé illékony és toxikus oldószerek. • Víz oldószer erőssége a legkisebb, alkalmazott szerves módosítok, melyek a retenciót csökkentik: metanol<acetonitril<eta-nol<tetrahidrofurán. • Ionizálható minta esetén pH kontroll kell. Alkalmazott pufferek: foszfát/foszforsav, acetát/ecetsav, ammónia/ammónium-klorid.

28. Funkciós csoportok polaritása: C-H < C-O-C < C-N-C < CN < C=O < HO-C=O < OH

29. Izokratikus elválasztásnál a 4 oldószer módszere

30. Gradiens elució A módszer előnyei: • Az analízis ideje lecsökken. • A felbontóképesség javul. • Keskenyebb csúcsok. • Nagyobb érzékenység. Gradiens elució Izokratikus elució

31. Gradiens programozás

33. Szerves módosítok hatása fordított fázisú kromatográfiás rendszerekben Termodinamikai leírása az adszorpciós jelenségeknek VR = vizsgált komponens retenciós térfogata V0 = holt térfogat G an. = vizsgált komponens adszorpciós energiája x = szerves módosító moltörtje G el. = eluens adszorpciós energiája (~oldószererősség) Ha x nő →Vr csökken Víz nem vesz részt az adszorpcióban, csak a szerves módosító. A komponensek és a módosító vetélkednek az adszorpciós helyekért. Kiszorításos modell.

34. Hidrofób rendszereknél! Retenciós térfogat / ml Acetonitril v/v%-a vízben

35. Alkil-benzolok, alkil-fenonok és alkil-parabének visszatartás változása a szénatomszám függvényében Szénatom szám

36. A pH szerepe az elválasztásban • Semleges vegyületek – nincs pH hatás Szénhidrogének, aromás szénhidrogének (PAH), halogénezett aromások (PCB), alkoholok, éterek, ketonok, aldehidek. • Savak és bázisok – pH változás hatására ionizálodnak • Ionos vegyületek – pH és puffer hatása 2. és 3. esetben a megoldás: • pH kontroll → szupresszió, ionos állapot visszaszorítása. • Ionpárképzés • Ioncsere kromatográfia

37. Savas csoportot tartalmazó szerves vegyületek visszatartás változása a pH függvényében RCOOH RCOO-/RCOOH pKa RCOO-

38. A pH és módosító hatása savas vegyület elválasztására tailing

39. Bázikus csoportot tartalmazó szerves vegyületek visszatartás változása a pH függvényében R-NH2 R-NH3+/R-NH2 pKb R-NH3+

40. A pH hatása bázikus vegyületek elválasztására Bázikus antihisztaminok pH=11 !!!)

41. Fordított fázisú ionpár-kromatográfia (RP-IP-HPLC) • A retenció növelése érdekében az eluensbe 1-100 mmol/L ionpárképző, hidrofób iont teszünk (felületaktív anyagok), melynek töltése ellentétes a meghatározandó anyagéval.

42. [Molekula ION]- N+ C18 állófázis Kationos ionpárképző és az állófázis elhelyezkedése

43. Az RP-IP-HPLC-ben fontos paraméterek • Ionpárképző koncentrációja (c nő → k nő). • Ionpárképző jellege (lánc hossz nő → k nő, egyenes lánc – elágazó lánc). • Szerves módosító típusa és mennyisége. • Puffer koncentrációja, pH-ja (ionos állapot biztosítása). • Idegen só koncentrációja.

44. A hőmérséklet hatása az elválasztásra H = 2 λdp + 2γDm + 8 k df2u uπ2 (1+k)2 Ds

45. DETEKTOROK • A detektor feladata a kiáramló eluensben mérni az összetevő pillanatnyi koncentrációját. A közvetlenül mért detektorjel általában nem maga a koncentráció, hanem annak valamilyen függvénye. Detektor típusok • Ultraibolya/ látható fény (UV/VIS), LOD: ~ 10-10 g • Fluoreszcenciás, LOD: 10-12 g • Vezetőképességi , LOD: 10-9 g • Törésmutató különbség mérése (RI), LOD: 10-8 g • Fényszórásmérésen alapuló (ELS), LOD: 10-8 g • Tömegszelektív (LC/MS), LOD: 10-15

46. Detektorok tulajdonságai • Alacsony zajszint és stabil alapvonal (low drift). • Megfelelő érzékenység. • Gyors jelképzés (12 pont/csúcs). • Széles linearitási tartomány. • Alacsony holttérfogat (csúcsszélesedés minimalizálása). • Könnyen kezelhető és megbízható. • Működési körülmények optimalizálhatósága.

47. Az elektronpályák relatív energiái és az elektrongerjesztések típusai

48. Spektrofotometriás detektorok Ezek az eluátum fényelnyelését mérik. Az ultraibolya, eset-leg az ultraibolya és a látható fény tartományban működnek. Lambert- Beer törvény: A = lg (Io/I) = ε×c×l Io = a megvilágító fény intenzítása I = fényintenzítás az abszorpció után c = koncentráció ε = abszorpciós együttható l = optikai úthossz

49. Spektrofotometriás detektorok típusai 1, Higanygőzlámpa, 254 nm, monokromatikus fény, (aromás rendszerek).

50. Átfolyó cella UV/VIS detektálásnál