Labor-Seminar 07.02.2007 Juliane Schmidt Und ganz viele Helfer!

1. Labor-Seminar 07.02.2007 Juliane Schmidt Und ganz viele Helfer! „Evaluierung und Validierung potenzieller molekulargenetischer Tumormarker in Urinproben von Patienten mit Verdacht auf Harnblasenkarzinom“

2. Einführung • Harnblasenkarzinom (BCa) • VierthäufigsterTumor beim Mann weltweit &neunthäufigsteUrsache eines tumorbedingten Todes • Zystoskopie (invasiv) & Urinzytologie: • Standardmethoden zur Diagnose und Überwachung • kein idealer BCa-Tumormarker zur nichtinvasiven Diangostik

3. Zielstellung • Etablierungstandardisierter Methoden zur quantitativen Transkriptmessung in Geweben (TUR-Späne) und Urinproben • Targetvalidierungan Gewebeproben (Tu-Tf) • Evaluierungverschiedener tumorassoziierter Faktoren (Survivin, XIAP, Ki67) als mögliche diagnostische und prognostische BCa-Marker

4. BCa-assoziierte Gene • Survivin & XIAP: “inhibitor of apoptosis proteins” (IAP) • Ki67: Proliferationsmarker, essential für Zellzyklus • selektiv überexprimiert in vielen Tumorarten inkl. BCa • Assoziation zwischen Überexpression und höherem Tumorstadium & Grad sowie mit ungünstiger Prognose ( SVV+Ki67 ) • geeignete Marker (Literatur: Gewebe und Urin) und therapeutische Targets für Antitumortherapien (z.B. Antisense-Studie)

5. Material & Methoden 1 • prospektive Studie: Februar 2006 – Januar 2007 • Einschlusskriterien: • Patienten mit Verdacht auf ein BCa (Neudiagnose oder Rezidiv) die sich einer transurethralen Resektion (TUR-BT) unterziehen • Ausschlusskriterien: • Patienten mit zusätzlichem Prostata-Ca • Patienten mit gutartigen Veränderungen ( z.B.Papillom ) • Patienten mit nicht-urothelialen Karzinomen (z.B.Adeno-Ca)

6. Material & Methoden 2 • Kontrollgruppen: • BPH-Patienten • Cystitis-Patienten • Gesunde • Cystektomiepatienten ( Sammlung läuft noch )

7. Material & Methoden 3 • BCa-Patienten: • prä-operative Urinprobe • intra-operatives Gewebe (Tumor & scheinbar normale Blasenmucosa) • post-operative Urinprobe (Sammlung ge- stoppt) • für jede TUR-BT (prim./sek./tert., aller 4-6 Wo.) • gleicher Zyklus auch bei Rezidiven • Kontrollen:1 Urinprobe

8. Behandlungsverlauf eines Blasenkarzinompatienten Rezidiv Primäre TURBT ca. 6-8 Wochen Rezidiv Sekundäre TURBT Cystektomie ca. 6-8 Wochen Cystektomie Tertiäre TURBT

9. Material & Methoden 4 • Sedimentation der Zellen aus dem Urin • Gewebekryoschnitte (Tf = 0%, Tu = 70-100%) • Isolation von total RNA und cDNA-Synthese • quantitative PCR für Survivin, XIAP & Ki67 und das Referenzgen TBP in Urin- & Gewebeproben • Korrelation der relative Expressionsniveaus von Survivin, XIAP & Ki76 (interne Normalisierung auf TBP) mit klinisch-pathologischen Aspekten

10. Bca-Patienten (N=106) • BT= 89 ( 84% ) NT= 17 ( 16% ) • Alter (median)= 70 Jahre (34 – 93) • M:F= 63 : 43 (59,4% : 40,6%) • Neudiagnose : Rezidiv= 92 : 14 (86,8% : 13,2%) • PSA(median; 58 Pat.) = 1,195 (0,16 – 33,91) • Tumorstadien:NT= kein Tumor nachweisbar n=17 pTa n=56 pT1 n=15 >PT1 n=17 NA n=1 cis:92 :14 (86,6% : 13,2%) • Tumorgrade:NT n=17 LMP (low malignancy potential) n=6 low grade n=17 high grade n=66

11. Kontrollen • BPH:n =34 67,5 Jahre (52-85J.) PSA-Median 2,105ng/ml (0,28-21,58) • Cystitis: n =6 49,5 Jahre (19-76J.) M : F = 1:5 • Gesunde: n =30 30 Jahre (18-59J.) M : F=7:22

12. Sensitivität Spezifität Positiv prädiktiver Wert (ppW) Negativ prädiktiver Wert (npW) 78% 75% 92% 36% Cytologie Vergleich mit unseren Daten folgt

13. Ergebnisse 1 • 2 Referenzgene getestet:TBPbesser als HPRT • Urinproben: negative Korrelation zw. Referenzgen-Expression & Erythrozyten / Leukozyten  viele Proben mit Ref.gen unter Nachweisgrenze von 10 Transkriptmolekülen • Gewebeproben:weniger Proben mit neg. Referenzgen • aufgrund technischer Probleme viele der ersten Proben verworfen oder cDNA nicht mehr ausreichend für vollständige Messung aller Gene

14. Ki67/TBP in ungepaarten Gewebeproben

15. XIAP/TBP in ungepaarten Gewebeproben

16. SVV/TBP in ungepaarten Gewebeproben

17. Ki67/TBP in Urinen von BCa-Patienten und Kontrollen Gesunde: fehlende Werte Nullgesetzt

18. XIAP/TBP in Urinen von BCa-Patienten und Kontrollen

19. SVV/TBP in Urinen von BCa-Patienten und Kontrollen

20. Ki67/TBP in Urinen in Abhängigkeit vom Tumorstadium

21. XIAP/TBP in Urinen in Abhängigkeit vom Tumorstadium

22. SVV/TBP in Urinen in Abhängigkeit vom Tumorstadium

23. Ki67/TBP in Urinen in Abhängigkeit vom Tumorgrad

24. XIAP/TBP in Urinen in Abhängigkeit vom Tumorgrad

25. SVV/TBP in Urinen in Abhängigkeit vom Tumorgrad

26. Schlussfolgerungen • Eignung als Tumormarker: Ki67,(SVV) • Abhängigkeit vom Tumorstadium: Ki67,SVV • Abhängigkeit vom Tumorgrad: Ki67,(SVV) • XIAPungeeignet: Expression im Prostata- gewebe => bei BPH Expression in Leukozyten => bei Cystitis

27. Ausblick 1 • gezielte Nachbeobachtung von Patienten ohne histologischen Tumornachweis (NT) • Abfall der Tumormarker nach der primären TUR-BT? • Statistische Signifikanz: möglich durch Kombination der Tumormarker ? (Verweis auf Prostata-Krebs-Studie) • Ausweitung der Tumorgene ( z.B. hTERT,CK20 ) • Vergleich mit Urinzytologie (Cutt-offs?)

28. Ausblick 2 • Geschlechtsspezifischer Test ( Probleme durch Einfluss von BPH ) • Korrelation Tumormarker im Urin und korrespondierenden Gewebe • Ausschlusskriterium Harnwegsinfekt:  Bakterienzahl oder positive Urinkultur? • Sammlung BPH- ,Cystitis-und Cystektomie-Patienten • Abschätzung der Rezidivhäufigkeit?