Some paradigmatic examples

1. Some paradigmatic examples

3. Absorbance Typical 1H NMR Spectrum

11. Valore medio: 2 MUSD/anno

12. 500 MHz 1H NMR K1  T2  L3  T4  L5  E6  A7  A8  L9  R10  N11  A12  W13  L14  R15  E16  V17  G18  L19  K20

13. Ubiquitin 76 amino acids, 8,5 kDa

14. Protein 1H NMR spectrum: a “real spectrum” The NMR signal in the time domain Free Induction Decay A short pulse will excite all spins All spins will relax (all together) during time AQ The FT of FID gives the NMR spectrum Fourier Transformation

18. 1D experiment ..Too crowded.. Chemical shifts relaxation rates Could be nice but... Not enough to get a structure What do we learn?

19. STRUTTURE IN SOLUZIONE VIA NMR

20. The need for multidimensional NMR

22. Cosa è un esperimento bidimensionale ? Dopo un impulso a 90° il segnale è pronto per essere acquisito Facciamo l’acquisizione ma NON terminiamo l’esperimento ed applichiamo ancora uno o piu’ impulsi in modo da perturbare ulterioremente il sistema Attraverso una combinazione di impulsi e delays noi facciamo in modo che ci sia uno scambio di magnetizzazione tra spin accoppiati SUCCESSIVAMENTE, acquisiamo il segnale una seconda volta, Registrando il segnale NMR che rimane sul piano xy dopo la perturbazione

23. Eccito (impulso a 90°)-Acquisisco (t1)- Perturbo (trasferisco)- Acquisisco (t2) Se la perturbazione non ha effetto e se non c’è trasferimento di alcun tipo, Ottengo lo stesso spettro in ciascuna delle 2 dimensioni tempo (t1 e t2) Dopo la trasformate di Fourier io otterro’ uno spettro dove i segnali appaiono su una diagonale di una matrice quadrata

24. Acquisisco (t1)- Perturbo (trasferisco)- Acquisisco (t2) Se durante la perturbazione una parte della magnetizzazione si traferisce da un nucleo ad un altro, per esempio per effetto di accoppiamento scalare, allora lo spettro della dimensione t2 sarà diverso da quello della dimensione t1. Il risultato è che avro’ dei segnali fuori dalla diagonale. Ciascun segnale fuori dalla diagonale darà l’informazione sugli accoppiamenti scalari attivi nel sistema M (wI t1) (wSt2)

25. O EXAMPLE H H N C C We make a 1H experiment and we acquire. I observe Hn Then all signals transfer the information because of scalar coupling H H N C Spectrum before The J coupling Then I observe Hc I consider the first and the second acquisition as two indpendent dimensions Spectrum after The J coupling

26. O EXAMPLE H H N C C Signal! This indicates that there is a scalar coupling between Hn and Hc H H N C Spectrum before The J coupling 9 ppm 4 ppm Spectrum after The J coupling

27. O EXAMPLE H H N C C Signal! This indicates that there is a scalar coupling between Hn and Hc H H N C Spectrum before The J coupling 9 ppm 4 ppm Hn Hn Hc J-coupling Spectrum after The J coupling

28. O EXAMPLE H H N C C If you begin from Hc , the situation is the same ! Spectrum before The J coupling Hc Hc Hn J-coupling Spectrum after The J coupling

29. O EXAMPLE H H N C C Therefore, if I consider only this system Hc Hc Spectrum before The J coupling Hn J-coupling Hn Hn Hc J-coupling Spectrum after The J coupling

30. The first dimension = t1 The second dimension = t2 the series of pulses that I have to apply to my system = PULSE SEQUENCE example t1 dimension Or F1 t1 t2 t2 dimension Or F2

31. Usually t1 is also defined as indirect dimension t2 is also defined as direct dimension the series of pulses that I have to apply to my system = PULSE SEQUENCE example t1 dimension Or F1 t1 t2 t2 dimension Or F2

32. Definitions Diagonal peak The same frequency is observed in both dimensions F1 Cross peak Two different frequencies are observed in the two dimensions F2 CROSS PEAK= Yes, There is a COUPLING between the two frequencies

33. Accoppiamento scalare L’accoppiamento scalare puo’ comunque essere osservato attraverso esperimenti NMR bidimensionali, quali il COSY

34. Example: COSY Through-bond connectivities H4’-H5’ H4-H5 COSY= COrrelation SpectroscopY

35. Example: COSY Through-bond connectivities 2 H4’-H5’ 4 H4-H5 3 5 6 COSY= COrrelation SpectroscopY 1

36. Beyond COSY COSY is not the only 2D experiment It is possible to transfer the information from spin A to spin B via several possible mechanisms The most important routes, which is COMPLEMENTARY TO J-coupling Is THROUGH SPACE COUPLING

37. Accoppiamento dipolare L’accoppiamento dipolare si ha tra due spin che sono vicini nello spazio Si tratta della interazione tra due dipoli magnetici, tra i quali, quando essi sono vicini nello spazio, si ha uno scambio di energia L’entità dell’effetto dipende dal campo magnetico e dalle dimensioni della molecola. Nel caso di spin 1H, l’accoppiamento dipolare si trasferisce per spin che si trovano a distanze inferiori ai 5 A. NON si osservano doppietti L’accoppiamento dipolare da luogo ad un trasferimento di magnetizzazione da uno spin all’altro. Questo effetto va sotto il nome di effetto NOE Nuclear Overhauser Effect Aumenta la intensità di B Perturbo A

38. Accoppiamento dipolare L’accoppiamento dipolare è “indipendente dall’accoppiamento scalare 2 spin possono essere accoppiati : -Scalarmente E dipolarmente se sono vicini nello spazio e legati da legami chimici -scalarmente ma non dipolarmente se sono legati da legami chimici ma non vicini nello spazio -dipolarmente ma non scalarmente se sono spazialmente vicini ma non legati da legamei chimici L’effetto NOE è osservabile in un esperimento NMR bidimensionale , detto NOESY (in realtà si puo’ anche osservare in esperimenti monodimensionle (1D NOE) di cui pero’ non parleremo Pensate a degli esempi, per favore

39. Through space AND throuhg bonds Through space Through bond

40. Example: Nuclear Overhauser Effect SpectroscopY NOESY NOE Effect: If two spins that are close in space are excited out of equilibrium, they will mutually transfer their magnetization AA AB

41. Example: The real case: Some 1500 peaks are observed for a protein of 75 aminoacids NOESY experiment Cross peaks: A and B are close Diagonal peak AA AB

42. 2D NOESY Spectrum

43. Distance constraints NOESY volumes are proportional to the sixth power of the interproton distance and to the correlation time for the dipolar coupling mJ B0 mI q r

44. The “old times” approach NOESY Identify through space connectivities HN(i)-Ha(i) and HN(i)Ha(i-1) Identify through bond connectivities HN(i)-Ha(i) COSY NOESY conn. COSY conn

47. 1J couplings for backbone resonances

48. 1J couplings for backbone resonances

49. The 2D Hetcor experiment Two dimensional Heteronuclear correlation Experiment

50. The 2D Hetcor experiment Two dimensional Heteronuclear correlation Experiment