Some paradigmatic examples

1. Some paradigmatic examples

2. Absorbance Typical 1H NMR Spectrum

4. Valore medio: 2 MUSD/anno

8. Valore medio: 2 MUSD/anno

9. 500 MHz 1H NMR K1  T2  L3  T4  L5  E6  A7  A8  L9  R10  N11  A12  W13  L14  R15  E16  V17  G18  L19  K20

10. Ubiquitin 76 amino acids, 8,5 kDa

11. 1D experiment ..Too crowded.. Chemical shifts relaxation rates Could be nice but... Not enough to get a structure What do we learn?

12. Occorrono informazioni strutturali, e correlazioni tra i vari spin che permettano l’assegnamento. Per ottenere cio’ é necessario osservare tutti i possibili accoppiamenti scalari e dipolari.

13. NMR MULTIDIMENSIONALE Gli spettri NMR monodimensionali permettono questo solo per molecole semplici e di basso peso molecolare. All’aumentare del PM, diventa impossibile individuare tutti gli accoppiamenti scalari dall’analisi dei multipletti e tutti gli accoppiamenti dipolari dagli esperimenti NOE monodimensinoali.

14. The need for multidimensional NMR

15. COSA SIGNIFICA Spettro NMR BIDIMENSIONALE

16. Cosa è un esperimento bidimensionale ? Dopo un impulso a 90° il segnale è pronto per essere acquisito Facciamo l’acquisizione ma NON terminiamo l’esperimento ed applichiamo ancora uno o piu’ impulsi in modo da perturbare ulterioremente il sistema Attraverso una combinazione di impulsi e delays noi facciamo in modo che ci sia uno scambio di magnetizzazione tra spin accoppiati SUCCESSIVAMENTE, acquisiamo il segnale una seconda volta, Registrando il segnale NMR che rimane sul piano xy dopo la perturbazione

17. PREPARAZIONE-ACQUISIZIONE t1- PERTURBAZIONE- ACQUISIZIONE (t2) 90° Aq F2 Aq F1 wA (F1) wA (F2) wA (F1) HA HA wA (F1) wB (F2) HB

18. Perché la magnetizzazione di uno spin dovrebbe trasferirsi su quella di un altro spin? Perché ci sono gli accoppiamenti scalari e gli accoppiamenti dipolari

19. Eccito (impulso a 90°)-Acquisisco (t1)- Perturbo (trasferisco)- Acquisisco (t2) Se la perturbazione non ha effetto e se non c’è trasferimento di alcun tipo, Ottengo lo stesso spettro in ciascuna delle 2 dimensioni tempo (t1 e t2) Dopo la trasformate di Fourier io otterro’ uno spettro dove i segnali appaiono su una diagonale di una matrice quadrata

20. Acquisisco (t1)- Perturbo (trasferisco)- Acquisisco (t2) Se durante la perturbazione una parte della magnetizzazione si traferisce da un nucleo ad un altro, per esempio per effetto di accoppiamento scalare, allora lo spettro della dimensione t2 sarà diverso da quello della dimensione t1. Il risultato è che avro’ dei segnali fuori dalla diagonale. Ciascun segnale fuori dalla diagonale darà l’informazione sugli accoppiamenti scalari attivi nel sistema M (wI t1) (wSt2)

21. O EXAMPLE H H N C C We make a 1H experiment and we acquire. I observe Hn Then all signals transfer the information because of scalar coupling H H N C Spectrum before The J coupling Then I observe Hc I consider the first and the second acquisition as two indpendent dimensions Spectrum after The J coupling

22. O EXAMPLE H H N C C Signal! This indicates that there is a scalar coupling between Hn and Hc H H N C Spectrum before The J coupling 9 ppm 4 ppm Spectrum after The J coupling

23. O EXAMPLE H H N C C Signal! This indicates that there is a scalar coupling between Hn and Hc H H N C Spectrum before The J coupling 9 ppm 4 ppm Hn Hn Hc J-coupling Spectrum after The J coupling

24. O EXAMPLE H H N C C If you begin from Hc , the situation is the same ! Spectrum before The J coupling Hc Hc Hn J-coupling Spectrum after The J coupling

25. O EXAMPLE H H N C C Therefore, if I consider only this system Hc Hc Spectrum before The J coupling Hn J-coupling Hn Hn Hc J-coupling Spectrum after The J coupling

26. The first dimension = t1 The second dimension = t2 the series of pulses that I have to apply to my system = PULSE SEQUENCE example t1 dimension Or F1 t1 t2 t2 dimension Or F2

27. Usually t1 is also defined as indirect dimension t2 is also defined as direct dimension the series of pulses that I have to apply to my system = PULSE SEQUENCE example t1 dimension Or F1 t1 t2 t2 dimension Or F2

28. Definitions Diagonal peak The same frequency is observed in both dimensions F1 Cross peak Two different frequencies are observed in the two dimensions F2 CROSS PEAK= Yes, There is a COUPLING between the two frequencies

29. Accoppiamento scalare L’accoppiamento scalare puo’ comunque essere osservato attraverso esperimenti NMR bidimensionali, quali il COSY

30. Example: COSY Through-bond connectivities H4’-H5’ H4-H5 COSY= COrrelation SpectroscopY

31. Example: COSY Through-bond connectivities 2 H4’-H5’ 4 H4-H5 3 5 6 COSY= COrrelation SpectroscopY 1

32. Beyond COSY COSY is not the only 2D experiment It is possible to transfer the information from spin A to spin B via several possible mechanisms The most important routes, which is COMPLEMENTARY TO J-coupling Is THROUGH SPACE COUPLING

33. Accoppiamento dipolare L’accoppiamento dipolare si ha tra due spin che sono vicini nello spazio Si tratta della interazione tra due dipoli magnetici, tra i quali, quando essi sono vicini nello spazio, si ha uno scambio di energia L’entità dell’effetto dipende dal campo magnetico e dalle dimensioni della molecola. Nel caso di spin 1H, l’accoppiamento dipolare si trasferisce per spin che si trovano a distanze inferiori ai 5 A. NON si osservano doppietti L’accoppiamento dipolare da luogo ad un trasferimento di magnetizzazione da uno spin all’altro. Questo effetto va sotto il nome di effetto NOE Nuclear Overhauser Effect Aumenta la intensità di B Perturbo A

34. Accoppiamento dipolare L’accoppiamento dipolare è “indipendente dall’accoppiamento scalare 2 spin possono essere accoppiati : -Scalarmente E dipolarmente se sono vicini nello spazio e legati da legami chimici -scalarmente ma non dipolarmente se sono legati da legami chimici ma non vicini nello spazio -dipolarmente ma non scalarmente se sono spazialmente vicini ma non legati da legamei chimici L’effetto NOE è osservabile in un esperimento NMR bidimensionale , detto NOESY (in realtà si puo’ anche osservare in esperimenti monodimensionle (1D NOE) di cui pero’ non parleremo Pensate a degli esempi, per favore

35. Through space AND throuhg bonds Through space Through bond

36. Quando lo spettro è troppo affollato di segnali, non è possibile fare esperimenti monodimensionali, perché non tutti i segnali sono disttinguibili dagli altri E’ quindi necessario u nesperimento bidimensionale, ovvero un esperimento che permette di trasferire la magnetizzazinoe da uno spin all’altro utilizzando l’accoppiamento dipolare

37. Example: Nuclear Overhauser Effect SpectroscopY NOESY NOE Effect: If two spins that are close in space are excited out of equilibrium, they will mutually transfer their magnetization AA AB

38. Example: The real case: Some 1500 peaks are observed for a protein of 75 aminoacids NOESY experiment Cross peaks: A and B are close Diagonal peak AA AB

39. 2D NOESY Spectrum

40. Distance constraints NOESY volumes are proportional to the sixth power of the interproton distance and to the correlation time for the dipolar coupling mJ B0 mI q r

41. The “old times” approach NOESY Identify through space connectivities HN(i)-Ha(i) and HN(i)Ha(i-1) Identify through bond connectivities HN(i)-Ha(i) COSY NOESY conn. COSY conn

44. La Spettroscopia NMR che utilizza sono spin 1H è solo un caso particolare della spettroscopia NMR bidimensinoale In effetti, accoppiamenti scalari e dipolari sono possibili anche tra spin diversi, es 1H e 13C 1H e 15N 13C e 15N 13C e 13C

45. In particolare, gli esperimenti che utilizzano accoppiamenti scalari tra spin diversi permettono di usare le 1J che di solito hanno valori maggiori e quindi danno esperimenti piu’ sensibili. Sarà pertanto possibile effettuare esperimenti bidimensionali dove in ciascuna delle due dimensioni si acquisicono nuclei diversi, per esempio 13C e 1H Otterremo un segnale nello spettro SE E SOLO SE abbiamo nel nostro sistema due spin (1H e 13C) che sono tra di loro accoppiati.

46. Questi esperimenti offrono molti vantaggi e aprono molte possibilità: • Spin 1H e 13C potranno essere direttamente accoppiati tra di loro aiutando la identificazione dei varigruppi e semplificando l’assegnamento • 2. Ogni picco permette di individuare due spin, semplificando il problema della identificazione dei segnali • Un esperimento bidimensionale offre una risoluzione molto maggiore perchéi segnali non sono separati solo in una dimensionale ma in una matrice bidimensionale, permettendo cosi’ l’analisi di sistemi anche piu’ complessi e non risolvibili in 1D

47. 1J couplings for backbone resonances

48. 1J couplings for backbone resonances

49. The 2D Hetcor experiment Two dimensional Heteronuclear correlation Experiment

50. The 2D Hetcor experiment Two dimensional Heteronuclear correlation Experiment