1 / 20

REPLIKACIJA DNA

REPLIKACIJA DNA. ZADACI.

iorwen
Download Presentation

REPLIKACIJA DNA

An Image/Link below is provided (as is) to download presentation Download Policy: Content on the Website is provided to you AS IS for your information and personal use and may not be sold / licensed / shared on other websites without getting consent from its author. Content is provided to you AS IS for your information and personal use only. Download presentation by click this link. While downloading, if for some reason you are not able to download a presentation, the publisher may have deleted the file from their server. During download, if you can't get a presentation, the file might be deleted by the publisher.

E N D

Presentation Transcript

  1. REPLIKACIJA DNA

  2. ZADACI • Watson i Crick predvidjeli su semikonzervativan način replikacije DNA. Tu pretpostavku dokazali su Meselson i Stahl. Bakteriju E. coli uzgajali su u mediju sa 15NH4Cl kao jedinim izvorom dušika, pa su takve bakterije posjedovale potpuno supstituiranu, 15N-DNA. Zatim su bakterije prebacili u medij koji sadrži izotopno neobilježeni 14NH4Cl i pomoću ravnotežne sedimentacije u gradijentu gustoće CsCl pratili razdiobu obilježene (15N-15N), upola obilježene (14N-15N) i neobilježene (14N-14N) DNA. Pokazali su da raspodjela izotopa u novosintetiziranoj DNA nakon jedne, dvije i tri generacije poštuje raspodjelu koja odgovara semi-konzervativnoj replikaciji.

  3. ZADACI • Neka su bakterije sa obilježenom 15N-DNA rasle tri generacije na mediju koji sadrži 14N izotop, koju raspodjelu molekula DNA (15N-15N; 14N-15N; 14N-14N) očekujete u stanicama kćeri? 15N-15N DNA 14N-15N DNA 14N-14N DNA • 1/8 1/8 6/8 • 1/8 0 7/8 • 0 1/8 7/8 • 0 2/8 6/8 • 0 4/8 4/8

  4. REPLIKACIJA DNA rastući lanac lanac-kalup

  5. DNA-POLIMERAZA I i III • ne mogu samostalno započeti sintezu, već trebaju klicu (primer) sa slobodnom 3' -OH skupinom • sintetiziraju novi lanac DNA od 5' prema 3' kraju (5'  3' smjeru), "čitajući" lanac-kalup u 3'  5' smjeru • egzonukleazna aktivnost: 3'  5' (i 5'  3') • procesivnost novonastali lanac klica 5' -OH -OH 3' 3' 5' kalup

  6. ZADACI • Genom bakteriofaga G4 sastoji se od male kružne jednolančane DNA. Replikacija započinje kada RNA-polimeraza (produkt dnaG gena E. coli) sintetizira mali segment RNA koji je komplementaran jedinstvenom slijedu baza na kromosomu G4. Do sinteze virusne G4 DNA ne dolazi u bakterijama koje imaju mutaciju u genu dnaG i zbog toga imaju inaktivnu RNA-polimerazu. Predložite funkciju malog segmenta RNA u sintezi G4 DNA. • Pretpostavite da su supstrati neobične DNA-polimeraze deoksiribonukleozid-3'-trifosfati, a ne deoksiribonukleozid-5'-trifosfati. Predložite i usporedite moguće mehanizme replikacije sa mehanizmom djelovanja DNA-polimeraza I i III.

  7. ZADACI 4. Koje se metode koriste u laboratoriju za umnožavanje ("kloniranje") fragmenata DNA? Objasnite njihov princip.

  8. ZADACI • KLONIRANJE POMOĆU VEKTORA Npr. PLAZMIDI: male kružne molekule DNA koje se repliciraju neovisno o genomskoj DNA i nisu neophodne za život bakterije MCS ampR ori

  9. ZADACI MCS ampR ori Shematski prikaz plazmida

  10. ZADACI MCS strana DNA vektor restrikcijske endonukleaze restrikcijska endonukleaza izolacija ciljnog fragmenta iz strane DNA, sljepljivanje sa vektorom, ligacija kimerni vektor

  11. ZADACI • PCR (polimerase chain reaction, lančana reakcija polimeraze) 5' 3' 3' 5' ciljni fragmet DNA

  12. ZADACI • PCR (polimerase chain reaction, lančana reakcija polimeraze) 95 °C denaturacija 5' 3' 5' 3'

  13. ZADACI • PCR (polimerase chain reaction, lančana reakcija polimeraze) 50 °C sljepljivanje klica (primera) 5' 3' HO- 5' 5' -OH 5' 3'

  14. ZADACI • PCR (polimerase chain reaction, lančana reakcija polimeraze) 72 °C sinteza lanaca DNA Taq DNA-polimerazom 5' 3' 5' 5' 5' 3'

  15. ZADACI • PCR (polimerase chain reaction, lančana reakcija polimeraze) drugi ciklus sinteze: 95 °C, denaturacija 5' 3' 5' 5' 5' 3'

  16. ZADACI • PCR (polimerase chain reaction, lančana reakcija polimeraze) drugi ciklus sinteze: 50 °C, sljepljivanje 5' 3' HO- -OH 5' 5' HO- -OH 5' 3'

  17. ZADACI • PCR (polimerase chain reaction, lančana reakcija polimeraze) drugi ciklus sinteze: 72°C, sinteza lanaca 5' 3' 5' 5' 5' 3'

  18. ZADACI • PCR (polimerase chain reaction, lančana reakcija polimeraze) na kraju trećeg ciklusa:

  19. ZADACI na kraju četvrtog ciklusa PCR-a: na kraju petog ciklusa PCR-a: 32 fragmenta dvolančane DNA 2 roditeljska (izvorišna) lanca + 10 dugačkih lanaca + 52 kratka lanca na kraju šestog ciklusa PCR-a: 64 fragmenta dvolančane DNA 2 roditeljska (izvorišna) lanca + 12 dugačkih lanaca + 114 kratka lanca nakon 30 ciklusa:  109 dvolančane DNA!

  20. ZADACI Obilježja PCR-a: • VELIKA AMPLIFIKACIJA: teorijski iz jedne dvolančane molekule DNA nakon 30 ciklusa nastaje oko 109 kopija • JEDNOSTAVNOST: pomiješaju se klice, kalup, dNTP-ovi i termostabilna DNA-polimeraza, a umnožavanje se postiže programiranim cikličkim mijenjanjem temperature • SPECIFIČNOST: malo je vjerojatno da će dvije različite klice "sjesti" upravo tako da omoguće amplifikaciju nekog slučajnog, neželjenog fragmenta • PRIMJENJIVOST: temelj molekularne biologije i manipulacije DNA; medicinska dijagnostika, forenzika,...

More Related