Molekulárno-genetická diagnostika genetických porúch

1. Molekulárno-genetická diagnostika genetických porúch Čo je molekulárno-genetické vyšetrenie a kedy sa indikuje? Indikáciou pre molekulárno-genetické vyšetrenie býva podozrenie, že daná patológia alebo predispozícia k určitému ochoreniu má genetický charakter, to znamená, že je zapríčinená mutáciou v jednom alebo vo viacerých génoch. Molekulárno-genetické vyšetrenie zahŕňa molekulárnu analýzu nukleových kyselín, najčastejšie genómovej DNA. Diagnostika na základe DNA analýzy predstavuje nový a veľmi perspektívny spôsob detekcie genetických porúch, ktorý umožňuje diagnostiku ochorenia aj v predklinickom štádiu, ba dokonca aj v prenatálnom období či predimplantačnej fáze. Možno očakávať, že v budúcnosti podstatne prispeje k spresneniu identifikácie patologických stavov vo všetkých odvetviach medicíny. Aké genetické variácie a patológie (mutácie) sa dajú vyšetriť molekulárno-genetickými metódami? Mutáciou sa označuje proces, ktorý spôsobuje trvalé zmeny v DNA. Mutácie môžu byť príčinou patologických stavov, alebo naopak, umožňujú získať nové alebo vylepšené funkcie. Podstatou mutácie sú buď veľké zmeny (strata, duplikácia, štrukturálna prestavba chromozómov) alebo bodové mutácie (býva postihnutý iba jeden alebo niekoľko málo nukleotidov v DNA). Bodové mutácie môžeme rozdeliť z molekulárneho hľadiska na delécie, inzercie a substitúcie jednej bázy. Z hľadiska funkcie sa rozdeľujú podľa toho, či postihujú kódujúce (exóny) alebo nekódujúce úseky DNA (regulačné sekvencie, promotóry a intróny). TYPY MUTÁCII: MISSENSE (mutácie meniace zmysel kodónu) – dôsledkom je aminokyselinová zámena, ktorá niekedy môže spôsobiť zmenu v biologickej aktivite proteínu. NONSENSE (nezmyselná mutácia) – dôsledkom je zmena kodónu pre aminokyselinu za jeden zo stop kodónov UGA, UAA, UAG, ktorá vedie k predčasnému ukončeniu translácie a k skráteniu polypeptidového reťazca proteínu. INZERCIA a DELÉCIA (vloženie alebo strata jedného alebo i rádovo miliónov nukleotidov v DNA). Dôsledky týchto mutácii závisia na počte a umiestení odstránených alebo včlenených nukleotidov, ale často môžu meniť biologickú aktivitu postihnutého proteínu. EXPANZIA TRINUKLEOTIDOV (dedičné nestabilné tandemové opakovanie trojice nukleotidov, napr. CGG pri syndróme fragilného X chromozómu). Prehľad molekulárno-genetických metód HYBRIDIZAČNÉ TECHNIKY: Southernova hybridizácia – študovaná DNA sa rozštiepi restrikčnou endonukleázou, DNA fragmenty sa rozdelia gélovou elektroforézou, prenesú (preblotujú) sa na nylonovú membránu a vizualizujú sa pomocou hybridizácie s rádioaktívne značenou sondou. POLYMERÁZOVÁ REŤAZOVÁ REAKCIA (PCR): základným predpokladom k úspešnej DNA analýze je získanie dostatočného množstva molekúl so sekvenciou, ktorá nás zaujíma. PCR je rýchla, ľahko použiteľná metóda pre zmnoženie (amplifikáciu) určitého úseku DNA in vitro. PCR-RFLP (polymorfizmus dĺžky restrikčných fragmentov): PCR/RFLP metóda je vhodná v prípade, že mutácia vytvára alebo ruší štiepne miesto pre restrikčnú endonukleázu. Po štiepení a následnej elektroforéze na základe rozdielnej dĺžky a mobility restrikčných fragmentov vieme určiť genotyp vo vyšetrovanej vzorke. ALELOVO ŠPECIFICKÁ PCR, ARMS (amplification refractory mutation system): metóda je založená na PCR reakcii, keď amplifikácia normálnej a mutovanej alely prebieha oddelene v 2 skúmavkách a vytvorí sa fragment zodpovedajúci genotypu vyšetrovaného. SSCP (konformačný polymorfizmus jednovláknovej DNA): SSCP je elektroforetická technika, pri ktorej analyzujeme denaturovaný – jednovláknový PCR produkt. Zmena, čo i len jediného nukleotidu v sekvencii, spôsobuje zmenu priestorového usporiadania vlákna DNA, ktoré sa prejaví ako zmena elektroforetickej mobility. METYLAČNE ŠPECIFICKÁ PCR (mPCR): je modifikáciou PCR, ktorá dokáže odlíšiť rôzne imprintovanú materskú a otcovskú alelu (imprintovaný gén je definovaný skutočnosťou, že je transkribovaný iba z 1 rodičovskej alely). Jej princípom je chemická premena nukleotidov. Cytozíny sú bisulfidovou reakciou pozmenené na uracily, pričom metylované cytozíny ostávajú nezmenené. V následnej mPCR sa uracil páruje s adenínom a metylovaný cytozín s guanínom. REVERZNÁ TRANSKRIPCIA PCR: templátom v PCR reakcii je komplementárna DNA, ktorá vznikla reverznou transkripciou mediátorovej RNA. REAL-TIME PCR: pri Real-Time PCR amplifikácii sledujeme nárast PCR produktu v reálnom čase (detekujeme zvyšovanie fluorescencie), na rozdiel od konvenčnej PCR keď robíme detekciu až po skončení reakcie. FRAGMENTAČNÁ ANALÝZA DNA: fragmentačná analýza DNA je založená na selektívnej amplifikácii DNA pomocou polymerázovej reťazovej reakcii (PCR), s dvoma primerami, z ktorých je jeden fluorescenčne značený, následnej kapilárnej elektroforéze vzoriek a detekcii fluorescenčne značených fragmentov laserom (determinujeme veľkosť daného fragmentu). MLPA (MULTIPLEX LIGATION-DEPENDENT PROBE AMPLIFICATION): pomocou tejto modernej metódy, sme schopný ma genetickom analyzátory identifikovať delécie a duplikácie génov alebo ich častí . SEKVENAČNÁ ANALÝZA DNA: sekvenovanie je analytická metóda naväzujúca na PCR, ktorou sme schopný čítať úsek DNA, ktorý nás zaujíma nukleotid po nukleotide. Táto metóda predstavuje “zlatý štandard“ v molekulárno-genetickej analýze. MIKROČIPOVÁ ANALÝZA NUKLEOVÝCH KYSELÍN: využitie DNA mikročipov v diagnostike genetických ochorení je síce len v počiatkoch, ale už dnes sú zjavné výhody tejto modernej hybridizačnej techniky. Jednoduchosť a veľká kapacita (jednou analýzou je možné vyšetriť tisíce génov) dáva tejto metóde veľkú perspektívu do budúcnosti. Aký biologický materiál sa dá využiť v molekulárno-genetickej diagnostike? V molekulárno-genetickej diagnostike možno využiť taký biologický materiál, ktorý obsahuje nukleové kyseliny. Rovnakú deoxyribonukleovú kyselinu (DNA) obsahuje takmer každá bunka (výnimkou sú len niektoré typy vysokodiferencovaných buniek), ale mediátorovú ribonukleovú kyselinu určitého génu, však nájdeme len v špecifických tkanivách, v ktorých je ten-ktorý gén exprimovaný. Čiže pre molekulárno-genetickú diagnostiku sa najčastejšie využívajú: LEUKOCYTY (plná krv v EDTA), FIBROBLASTY, CHORIOVÉ KLKY, AMNIOVÉ BUNKY, BLASTOMÉRY, SPERMIE a INÉ TKANIVÁ Nakoľko je DNA veľmi stabilná, dá sa úspešne naizolovať aj zo vzoriek starých niekoľko tisíc rokov, napr. z múmie, či z kostných pozostatkov z mamutov. Taktiež už izolovanú DNA je možné uchovávať pri –70ºC neobmedzene dlhú dobu, čoho veľkou výhodou je, že v budúcnosti bude možné vykonať z uskladnenej DNA aj také molekulárno-genetické vyšetrenia, ktoré sú v súčasnosti nedostupné. Využitie molekulárno-genetických metód pri zisťovaní génovej expresie Génová expresia = realizácia génovej informácie, ktorá pozostáva z trankripcie (prepisu) sekvencie nukleotidov v genómovej DNA, ktorá slúži ako matrica pre syntézu jediného reťazca mediátorovej ribonukleovej kyseliny (mRNA). Po prestupe z bunkového jadra do cytoplazmy, slúži zrelá mRNA ako matrica na syntézu špecifického polypeptidu – proteínu (translácia). Celý proces biosyntézy prebieha na ribozómoch, začína sa kodónom (tripletom nukletidov, ktorý kóduje jednu aminokyselinu) pre štart AUG, ktorý špecifikuje metionín a končí sa jedným zo stop kodónov (UAA, UGA, UAG). Génovú expresiu niektorého špecifického génu v určitom tkanive (teda množstvo syntetizovanej mRNA) môžeme kvantifikovať pomocou viacerých metód. Na analýzu sa najčastejšie využíva komplementárna DNA (cDNA), ktorá vznikla reverznou transkripciou mRNA. Najpresnejšou metodikou pre stanovenie génovej expresie jedného génu je kvantitatívna polymerázová reakcia v reálnom čase (Real-Time PCR, RT-PCR, Q-PCR). Naproti tomu pomocou mikročipovej analýzy je možné, síce menej presne, analyzovať desiatky tisíc génov simultánne.