Últimas notícias do “El Dorado ” das células pluripotentes induzidas ( iPS’s )

1. Licenciatura em Biologia Humana 2º Ano (4º Semestre) Ano Letivo 2011/2012 Júri: Prof. Fernando Capela Prof. Paulo de Oliveira Últimas notícias do “El Dorado” das células pluripotentes induzidas (iPS’s) Elaborado por: Maria Ferreira nº 27496 Mariana Ascensão nº 27756 Biologia do Desenvolvimento – 28 de Junho de 2012

2. “Stem Cells” Diferenciar em células especializadas Autorrenovar Células indiferenciadas Embrião 2 Fontes Tecidos adultos

3. “Stem Cells” • De acordo com o tipo de células que podem gerar dividem-se em: • Totipotentes • Pluripotentes • Multipotentes • Oligopotentes • Unipotentes Figura 1 – “Stem cells” pluripotentes

4. Células iPS • “Stem cells” pluripotentes derivadas artificialmente de células não-pluripotentes pela indução de uma manifestação “forçada” de certos genes • Não são obtidas a partir do embrião, mas sim de células diferenciadas

5. História das células iPS • Yamanaka (2006) – 1ª vez que se geraram iPSCs a partir de fibroblastos de ratinhos • Foram isolados 4 genes essenciais para a produção de “stem cells” • Yamanaka (2007) – descobriu que: • Nanog um dos principais determinantes da pluripotência celular • c-Myc é oncogénico

6. História das células iPS • Yamanaka (2007) – transformou fibroblastos humanos em células iPS’s • Hochedlonger (2008) - utilizou um adenovírus para transportar os 4TF para o DNA de célula da pele e fígado de ratinhos • Yamanaka (2008) - concluiu que se poderiam transferir os 4 genes necessários com um plasmídeo Figura 2 - Yamanaka

7. História das células iPS • Freed (2009) – demonstrou outra vantagem do adenovírus • Morrisey (2011) – usou microRNAs, melhorando a eficiência da reprogramação

8. Produção de células iPS • Células para reprogramação: • Eficácia, período de tempo e extensão da reprogramação varia conforme as células iniciais • Tecidos da medula óssea são uma fonte de “stem cells” Cirurgia invasiva e dolorosa

9. Produção de células iPS Figura3 – Indução de iPSC’s

10. Produção de células iPS Células Adultas Geração de iPSC Células adultas podem ser reprogramados para um estado pluripotente pela expressão “forçada” de alguns fatores embrionários de transcrição

11. Produção de células iPS • Eficiência da produção extremamente baixa • Se forem usados vírus poderá haver alteração genética das células e a expressão de oncogenes pode ser acionada • iPSC’s são tipicamente derivadas por transfecção de certas células Exemplo: Fibroblastos

12. Influência do estado de diferenciação das células • O estado de diferenciação da célula alvo influencia a sua suscetibilidade para a reprogramaçãoe para o potencial de diferenciação das iPSC’s daí derivadas • Stemcells de músculo de rato reprogramam com maior eficiência que as suas células filhas mais diferenciadas (mioblastos e fibroblastos)

13. Genes de indução • Reguladores transcricionais cruciais envolvidos no processo de indução, cuja ausência torna impossível a indução • Oct-3/4 • Sox2 Geração de iPSC’s Genes utilizados para a indução depende

14. Genes de indução • Fatores adicionais para ↑ eficiência da indução: • Klf4 • c-Myc • Nanog • LIN28 Transferência dos 4TF, exceto c-Myc oncogénico Células Adultas Células iPS • Processo: • + lento • - eficaz • Não se desenvolve cancro

15. Genes de indução • Oct-3/4 • Papel crucial na manutenção da pluripotência • Ausência → conduz à diferenciação • Sox2 • Semelhante ao Oct-3/4 → mantém pluripotência • Expresso em “stem cells” pluripotentes e unipotentes • Klf4 • fator capaz de gerar células iPS

16. Genes de indução • c-Myc • Mostrou-se desnecessários para a geração de iPSC’s humanas • Oncogene → por isso o seu uso é preocupante • Nanog • Necessário para promover pluripotência • Poder de renovar “stem cells” • Ausência → rápida diferenciação • Desnecessário para a indução • LIN28 • Fator de geração de iPSC’s • Desnecessário

17. p53 • Proteína supressora de tumores • Principal inibidora da geração de células iPS • Liga-se diretamente ao promotor do Nanog para suprimir o seu nível de expressão Inicia-se a diferenciação de “stem cells” em células adultas • Deleção do gene p53 ↑ eficiência de geração de iPSCs em 1000x

18. p73 • Proteínas envolvida na geração de células iPS humanas • Possui 2 promotores alternativos: • TAp73 funções semelhantes à p53 • DNp73inibe o p53 e o p73 ↑a expressão Nanog pode ↑eficiência da geração de iPSC’s humanas células geradas com a sua expressão são + resistentes à diferenciação (in vitro e in vivo)

19. DNp73 • Os 2 promotores da p73 têm papéis opostos • Linet aldescobriu que a adição do gene humano de DNp73 ↑ a geração de iPSC’s • Condições basais: • Oct-3/4 • Sox 2 • Klf4 • c-Myc Condições basais + DNp73 Gráfico 1 – Colónias de iPSC humanas

20. DNp73 • Contribui diretamente para a expressão do Nanog e do Oct-3/4 Manutenção da pluripotência Gráfico 2 – Expressão de fatores de transcrição

21. Proteínas recombinantes • Até 2009, todos os métodos desenvolvidos envolviam a utilização de materiais genéticos Possibilidade de ocorrerem modificações genéticas Tumores • Hongyanet al • Utilizaram proteínas recombinantes capazes de reprogramação celular piPSC’s

22. Proteínas recombinantes • Hongyanet al Autorrenovam-se Pluripotentes in vitro e in vivo piPSC’s Evitam introdução de modificações genéticas

23. Proteínas recombinantes • piPSC’s • Foram criadas em ratinhos Indistinguíveis das “stem cells” embrionárias • Exigem métodos de aperfeiçoamento • Representa um avanço em relação aos outros métodos Vantagens

24. Proteínas recombinantes • Vantagens: • Elimina o risco de modificar o genoma da célula-alvo Oferece um método para gerar iPSC’s + seguras • Confere uma abordagem + simples e + rápida • Poderia potencialmente permitir a aplicação de uma metodologia de reprogramação mais ampla e mais económica produção de proteína recombinantes em larga escala

25. Obstáculos • Reduzido número de células • Falta de metodologias simples • Custos • Rendimento • Inserção genómica • Rejeição Imunológica • Teratomas

26. Vetores Alternativos • Plasmídeos – evita vírus, necessita de oncogenes e é menos eficiente • Adenovírus – não incorpora os seus genes no hospedeiro alvo e necessita de pouco tempo de apresentação • Proteínas recombinantes

27. Semelhanças entre iPSC’s e ‘stemcells’ Propriedades celulares biológicas: • Morfologia – forma redonda, nucleótidos grandes e citoplasma escasso • Propriedades de crescimento – tempo de duplicação e atividade mitótica • Marcadores de stemcells- iPS humanas expressam os marcadores específicos para hESC, incluindo SSEA-3, SSEA-4, TRA-1-60, TRA-1-81, TRA-2-49/6E e Nanog • Genes de ‘stemcells’ – Oct-3/4, Sox2, Nanog, GDF3, REX1, FGF4, ESG1, DPPA2, DPPA4 e hTERT • Atividade da telomerase – hESCs expressam alta atividade de telomerases para sustentar a autorrenovação e proliferação e assim como as iPS

28. Semelhanças entre iPSC’s e ‘stem cells’ Plutipotência: • Diferenciação neural – iPS diferenciadas em neurónios, expressando βIII-tubulina, tirosina hidroxilase, AADC, DAT, Chat, LMX1B e MAP2 • Diferenciação cardíaca – iPSC diferenciadas em cardiomiócitos • Formação de teratomas • Quimeras de ratinhos • Complementação tetraploide

29. Vantagens e desafios das iPSC’s • Grande plasticidade celular • Não geram riscos de rejeição imune • Possibilidade de modelos de doenças in vivo • Possibilidade de reparação de doenças por mutações A eficácia de indução de iPSC’s é muito baixa dando origem a células insuficientemente reprogramadas

30. Medicina personalizada • A tecnologia das iPS tem potencial para avançar com a terapia médica personalizada, a medicina regenerativa e criar novos modelos de doenças humanas para pesquisa e testes terapêuticos • Uso de iPSC’spara a terapia de doenças incuráveis: produção de células adultas específicas para cada paciente e doença específica

31. Medicina personalizada • O transplante de órgãos exige disponibilidade de tecidos e tratamento com imunossupressores • As iPSCshumanas poderiam ser induzidas nos tipos de células desejados e seriamgeneticamente compatíveis com o paciente • Surgiram discussões sobre o fornecimento de terapias celulares em humanos, nomeadamente para pacientes com doenças debilitantes e distúrbios neurológicos – Questão ética

32. Um futuro aberto • É necessário superar a barreira que está entre a eficiência e a integração genómica. • Caracterização proteómica de iPSC’s. • Uso de iPSC’s para identificar fármacos terapêuticos capazes de resgatar um fenótipo. Por exemplo, linhas de células iPS derivadas de pacientes afetados pela síndrome de displasia ectodérmica (CEE), onde o gene p63 está mutado, exibem um compromisso epitelial anormal que poderia ser parcialmente resgatado.

33. Potenciais aplicações das iPSC’s • Modelação de doenças • Descoberta de fármacos • Terapia genética • Terapia de substituição/reprogramação • Terapia para o Parkinson • Terapia para reparação cardíaca • Terapia para reparação hepática

34. Conclusões • Estas técnicas de geração de células iPS são revolucionárias pois, anteriormente só se podiam obter células pluripotentes a partir do embrião e agora, é possível obtê-las a partir de células adultas. • A eficiência das iPSC é muito baixa células insuficientemente rerogramadas

35. Conclusões • A utilização de vírus pode levar a alterações genómicas • Reguladores transcricionais cruciais envolvidos no processo de indução, cuja ausência torna impossível a indução • Importante descoberta para a terapêutica.

36. FIM

37. Biografia • Linet al. DNp73 improves generation efficiency of human induced pluripotent stem cells. BMC CellBiology. 2012; 13:9 • TAN, KahYonget al. Efficient Generation of iPS Cells from Skeletal Muscle Stem Cells. PLoS ONE. Outubro 2011; vol. 6 • ZHOU, Hongyanet al. Generation of Induced Pluripotent Stem Cells UsingRecombinantProteins. CellPress. Maio 2009

38. Fonte das imagens • Figura 1 - “Stem cells” pluripotenes em http://dererummundi.blogspot.pt/2008/03/clulas-estaminais-e-expresso-gnica.html • Figura 2 – Yamanaka em http://www.gladstone.ucsf.edu/gladstone/site/publicaffairs/content/1/648 • Figura 3 – Indução de iPSC’s em http://en.wikipedia.org/wiki/File:Induction_of_iPS_cells.svg • Gráfico 1- Colónias de iPSCs humanas em Linet al. DNp73 improves generation efficiency of human induced pluripotent stem cells. BMC CellBiology. 2012; 13:9 • Gráfico 2 - Expressão de fatores de transcrição em Linet al. DNp73 improves generation efficiency of human induced pluripotent stem cells. BMC CellBiology. 2012; 13:9