1 / 28

JEL ELEKTROFOREZİ SDS-PAGE

JEL ELEKTROFOREZİ SDS-PAGE. FFMBG103. JEL ELEKTROFOREZİ. Büyüklük, yük ve konformasyon bakımından birbirlerinden farklılık gösteren yüklü makromolekülleri (protein, nükleik asit) iyonik bir ortamda birbirinden ayırtetmek için kullanılır.

isla
Download Presentation

JEL ELEKTROFOREZİ SDS-PAGE

An Image/Link below is provided (as is) to download presentation Download Policy: Content on the Website is provided to you AS IS for your information and personal use and may not be sold / licensed / shared on other websites without getting consent from its author. Content is provided to you AS IS for your information and personal use only. Download presentation by click this link. While downloading, if for some reason you are not able to download a presentation, the publisher may have deleted the file from their server. During download, if you can't get a presentation, the file might be deleted by the publisher.

E N D

Presentation Transcript

  1. JEL ELEKTROFOREZİSDS-PAGE FFMBG103

  2. JEL ELEKTROFOREZİ • Büyüklük, yük ve konformasyon bakımından birbirlerinden farklılık gösteren yüklü makromolekülleri (protein, nükleik asit) iyonik bir ortamda birbirinden ayırtetmek için kullanılır. • Protein yada DNA/RNA elektriksel bir ortamda makromolekülün yükü ile doğru orantılı ancak şekli ve büyüklüğü ile ters orantılı bir hızda hareket ederler. • Aminoasit, peptit, nukleotit, nukleik asit; yüklü moleküller • Net yüke göre elektriksel ortamda hareket, ya pozitif (anot) ya da negatif (katot) kutuba • DNA/RNA fosfat grupları nedeni ile sabit – yüklü olup pozitif elektroda doğru hareket ederler

  3. Bir partikülün göç oranını etkileyen faktörler • Elektriksel alan gücüne • Partikülün net yüküne • Elektroforez ortamının yoğunluğu

  4. Elektroforez tipleri • Poliakrilamit jel elektroforezi (PAGE): proteinler ve DNA sekans analizinde 500 bç nin altındaki nükleik asitleri ayrılabilir • Native PAGE • Native Gradient PAGE • Urea PAGE • SDS PAGE • SDS Gradient PAGE • IEF • 2D PAGE • Western Blot • Agaroz jel elektroforezi: 50 kb a kadar büyüklükteki nükleik asitlerin ayırt edilmesi • Pulse field Jel elektoforezi: 10 Mb a kadar büyüklükteki moleküllerin ayırımı

  5. PAGE’in kullanım alanları • Araştırmalarda sıklıkla kullanılır • Protein ve nükleik asitlerin saflıklarının kontrolü • Oligonukleotit sekans analizi • Proteinlerin molekül ağırlıklarının ve izoelektrik pH larının belirlenmesi • Protein ve enzim eldesi • Western blotlama

  6. PAGE • Poliakrilamit-matriks • Akrilamid- ana gövdeyi oluşturur • N,N metilen bisakrilamit- çapraz bağlanmalardan sorumludur • N,N,N’,N’tetrametiletilendiamin (TEMED)- katalizör • Amonyum persülfat (APS)- radikal oluşumu-polimerizasyonnun başlaması

  7. SDS-PAGE- Proteinlerin denatüre edildikleri sistem • NATIVE PAGE- Proteinlerin denatüre edilmeden doğal halleriyle analiz edildikleri sistem

  8. Proteinlerin denatürasyonu neden gereklidir? • Molekülün büyüklüğü ve üç boyutlu yapısı bulunduğu ortamdaki hareketini etkiler • Aynı büyüklükteki protein molekülünün ikincil, üçüncül ve dördüncül yapılarının kaldırılması aynı hızda hareketini sağlar • Deterjan kullanımı-Denatürasyon-SDS Hidrofobik etkileşimleri çözer, negatif yükü nedeniyle protein yapısına negatif yük katar

  9. SDS yapısı • Proteinlerin üç boyutlu yapısını kırar Protein-lineer yapı ve negatif yük kazanır SDS öncesi Yüklü R grupları Hidrofobik alanlar SDS sonrası Eğer proteinler denatüre edilip elektriksel ortama bırakılırsa proteinlerin hepsi aynı hızda, büyüklüklerine bakılmaksızın pozitif kutba doğru hareket edeceklerdir

  10. Sorun: Farklı büyükkükteki proteinleri aynı ortamda nasıl farklı hızda yürütebiliriz? • Poliakrilamit ortam Akrilamit/bisakrilamit: 19/1 maksimum çapraz bağlama Polimerizasyon ve çapraz bağlanma. Akrilamit/bisakrilamit oranı ve her iki bileşenin toplam konsantrasyonu finalde ortaya çıkan jel matriksin por büyüklüğünü, ve katılığını etkiler. Bu ise yürüyecek proteinlerin hızını etkiler

  11. SDS-PAGE • Vakit alıcıdır • Oksijen varlığı polimerizasyonu engeller, bu sebeple cam plakalar arasına dökülür • Gözenek oluşumu kimyasal bir işlem olduğundan çok düzenli ve tek tip gözenek büyüklüğünde matriks oluşturulur • Gözenek büyüklüğü kullanılan akrilamid miktarı ile ters orantılıdır. 7% poliakrilait jel %12 lik olandan daha büyük gözenek içerir • Akrilamit nörotoksiktir • Polimerleşince tehlike arzetmez • Çok sayıda çapraz zincirler ve dallanmalar küçük moleküllerin daha hızlı hareketini sağlar

  12. Kullanılan tampon • Yürütme tamponu Jel içerisinde ve elektroforez tankında istenilen değerde pH değerinin sabitlenmesini sağlar . Tris-glisin-SDS tamponu 0.025MTris,0.192MGlisin,%0.1SDS,pH8.3 Bu tampon sistemi bir poliakrilamit matrikstemoleküler ağ etkisiyle denatüre protein-SDS kompleksini ayırır. Matrisin por büyüklüğü proteinlerin ayrılma etkinliğini belirler ve proteinlerin moleküler ağırlığına bağlıdır

  13. Poliakrilamid jel birbirinden belli uzaklıkta (0,5-2,0 mm)tutulan iki cam tabaka arasında ve genelde 8-10 cm ya da 10-10 cm boyutunda hazırlanır.DNA dizileme çalışmalarında daha çok 20-40 cm boyutunda hazırlanır. • Polimerizasyon sırasında jelin üst kısmına yerleştirilen plastik bir tarak jelde küçük kuyucukların oluşumunu sağlar .Polimerizasyondan sonra tarak çıkarılır,kuyucuklar tuzları ve polimerize olmamış akrilamidi yok etmek üzere tamponla yıkanır. • Jel kaseti iki tampon arasına yerleştirilir;kuyucuklara örnekler konulur ve akım geçirilir. • Elektroforez bitiminde görüntüleme için jel uygun boya ile boyanır.

  14. Jelin hazırlanması ve dökümü Kuyucuklar İstifleme jeli Ayırma (koşturma) jeli Tampon

  15. Koşturma jeli (tamponu 1.5MTris-Cl,pH8.8) • Toplam jelin ¾’ünü oluşturur • Elektroforez sırasında separasyonun sağlandığı kısım • Gözenekli bir yapıdadır • Jelde gözeneklerin büyüklüğü jeli oluşturmak için birbirlerine çapraz bağlarla bağlanan akrilamid monomerlerinin konsantrasyonu ile ilgilidir. • % Akrilamid & örnek moleküler ağırlığına göre belirlenir

  16. Por büyüklüğü ve akrilamid konsantrasyonuna göre proteinlerin ayrılmaları

  17. İstifleme (yükleme) jeli (tamponu 0.5 M Tris-Cl,pH6.8) • Separasyon jeli polimerleşince onun üzerine dökülür ve hemen ardından üzerine tarak yerleştirilerek örnek kuyucukları oluşturulur

  18. Örnek hazırlığı ve jele yükleme • Protein izolasyonu • Konsantrasyonunun belirlenmesi • Örneklerin denatürasyonu: örnek tamponu ile karıştırmak; 95 oC’de 5-10 dak. İnkübasyon • Yükleme (örnek tamponu) : 0.125M Tris, %4 SDS, %20 Gliserol, %10 β-merkaptoetanol, Bromophenol blue

  19. Camların %70 lik alkol ve saf su ile temzilendikten sonra düzeneğe yerleştirilmesi ve jellerin dökülmesi tarağın yerleştirilmesi

  20. Örneği denatüre etme, jeli tanka yerleştirme

  21. Örnek yükleme, düzeneğin tamamlanması

  22. Koşturma-boyama-yıkama

  23. Jellerin boyanması • Coomassie Blue boyama Coomassie R: Jel üzerinde yaklaşık 100 ng proteini tespit edebilir Coomassie G: 10 ng proteini tespit edebilir • Floresan boyalar • Spesifik, 1 ng dan daha az proteinleri tespit edebilir, nükleik asitleri boyamaz • Silver staining (gümüş boyama): Hassas bir teknik, • Proteinlerin jel matriksine tespiti, gümüş iyonlarının proteinlere bağlanması, formamid ileredüksiyon, görüntülme

  24. Protein büyüklüklerinin hesaplanması Rf (hareket)

  25. Protein büyüklüklerinin hesaplanması • Her bir Standart bandın ilerleme yolu yükleme boyasının gittiği yolun uzunluğuna bölünür: Rf değeri

  26. Kaynakça • B429 Moleküler Biyolojide temel teknikler uygulama klavuzu ( Doç Dr. Özlem Osmanağaoğlu, Araş. Gör. Fatma Kıran • http://www.tulane.edu/~wiser/methods/homework/HW5_key.pdf • http://radio.cuci.udg.mx/bch/EN/SDS.html • webgentech.org/uploads/protocol/tr/sds.pdf • tip.kocaeli.edu.tr/docs/tibbi.../laboratuvarIII.doc

More Related