Universidade Federal de Santa Catarina

1. Universidade Federal de Santa Catarina Cinética Enzimática Estágio de Docência Juliana Ribeiro Mariotto

2. Objetivos • Medir velocidade das transformações; • Estudar a influência das condições de trabalho; • Correlacionar: velocidades  fatores; • Otimização do processo; • Critérios para o controle; • Projetar o reator mais adequado.

3. Influência do Substrato • Concentração de substrato [S]: afeta a velocidade da reação; • Efeito de [S]: varia durante o curso de uma reação S  P; • Velocidade inicial (V0): [S] >> [E]  tempo muito curto  [S] = constante.

4. Influência do Substrato • [E] = cte •  [S] = V0 linear •  [S] = V0 • V0= Vmáx

5. Influência do Substrato • Alguns casos a V0 não pode ser medida • Não existe técnica experimental; • Equação química não representa a transformação; • Velocidade da reação: • Velocidade média de consumo ou produção; • Variação de uma propriedade no sistema.

6. Influência do Substrato • Vitor Henri (1903): E liga-se ao S para formar ES  passo obrigatório; • Leonor Michaelis e Maud Menten (1913) • E combina-se reversivelmente com S ES k1 E + S ES k-1 • ES se rompe  E e P k2 ES E + P

7. Influência do Substrato • Qualquer instante da reação: E e ES; • [S]  = velocidade da reação  [S]; • Vmáx= todas as moléculas de E estiverem na forma ES  enzima “saturada”; •  [S]: estado pré-estacionário   ES; • Estado estacionário  [ES] = cte; • V0 estado estacionário.

8. Equação Michaelis-Menten • Curva: possui a mesma forma para a maioria das enzimas; • Expressa pela Equação de Michaelis e Menten; • Hipótese: limitante  quebra de ES  E + P.

9. Equação Michaelis-Menten • Equação da velocidade para uma reação catalisada enzimaticamente e com um único substrato; • Relação quantitativa entre a V0, a Vmáx e a [S] inicial relacionadas através de Km.

10. Equação Michaelis-Menten • Relação numérica: V0é metade de Vmáx; • km = “afinidade” pelo substrato;  Km  afinidade • Vmáx é proporcional à [E].

11. Significado de Km e Vmáx • Equação Michaelis e Menten = dependência hiperbólica; • Mecanismos de reação diferentes  catalisam reações com 6 ou 8 passos; • Significado e magnitude de Vmáxe Kmvaria; • Km: depende de aspectos específicos do mecanismo de reação.

12. Significado de Km e Vmáx • K2 << K-1 afinidade da enzima; • K2 >> K-1; • K2e K-1 são comparáveis a Km função complexa; • Vmáx: número de passos da reação e identidade dos passos limitantes.

13. Significado de Km e Vmáx • Enzima na saturação: EP e Vmáx = k3.[Et]; • Kcat = velocidade limitante de qualquer reação  enzimas saturadas; • Kcate Km= ambiente celular, concentração do substrato e química da reação. K1 K2 K3 E + S ES EP E + P K-1 K-2

14. Reação de 1ª Ordem • [S] << Km • k = constante de velocidade de 1ª ordem (min-1) • [S]  V0 • Fração constante de S  P

15. Reação de 1ª Ordem • Determinar S utilizado ou P formado durante qualquer intervalo de tempo  Equação integrada de 1ª ordem.

16. Reação de 1ª Ordem • t1/2 = tempo de “meia vida”  tempo necessário para converter em P metade do S presente.

17. Reação de Ordem Zero • [S] >> Km

18. Parâmetros Cinéticos • Lineweaver-Burk

19. Parâmetros Cinéticos • Método de Hanes

20. Parâmetros Cinéticos • Método de Eadie-Scatchard

21. Parâmetros Cinéticos • Forma integrada

22. Parâmetros Cinéticos • Exemplo: [S] (g/L) Vo(g/L.h) 0,25 0,78 0,51 1,25 1,03 1,66 2,52 2,19 4,33 2,35 7,25 2,57

23. Parâmetros Cinéticos • Exemplo: Lineweaver-Burk

24. Parâmetros Cinéticos • Exemplo: Método de Hanes

25. Inibidores Competitivos • Forma estrutural = substrato  competição; • Porcentual de inibição  concentrações e afinidade pela enzima.

26. Inibidores Competitivos •  [S] Vmáx = Km • Experimento • 1º  [E], [S] = cte • 2º  [E], [I] = cte 1/V0x 1/[S]

27. Inibidores Competitivos • Equação de Michaelis e Menten • Lineweaver-Burk

28. Inibidores Competitivos • Relação entre as velocidades com e sem inibidor • [S]  = influência do [I] desprezível.

29. Inibidores Não-Competitivos • Ocupa outro sítio  ES, EI e EIS; • [S]  = não leva todas as E  produtiva; • Vmáx  e Kmnormal.

30. Inibidores Não-Competitivos • Equação da velocidade: • Lineweaver-Burk

31. Inibidores Incompetitivos • Bloqueio de ES; • 2 sítios ativos  I se fixa no complexo ES; • ESI = não forma P; • Vmáx e Km

32. Inibidores Incompetitivos • Equação da velocidade: • Lineweaver-Burk:

33. Inibidores Incompetitivos

34. Inibidores Irreversíveis • Combinam-se com um grupo funcional  destruição; • União covalente  inibidor e enzima. • Vmáx e Km=

35. Inibidores Irreversíveis • Equação de Michaelis e Menten:

36. Inibidores Irreversíveis • Lineweaver-Burk:

37. Influência do pH • Valor de pH ótimo = atividade máxima; • Velocidade da reação:  pH afasta do ótimo; • Influência do pH: análise dos grupos dissociáveis; • Ácidos (Brönsted): compostos capazes de dissociar-se, liberando H+.

38. Influência do pH HA  A + H+ • pH   HA   A  • Aminoácidos: • pH   -COO- captam prótons = -COOH; • pH   -NH3+ são dissociados = NH2; • Ligação eletrostática = -COO- -- NH3+.

39. Influência do pH • pH ótimo depende do número e tipo de grupos ionizáveis  estrutura primária; • Variações do pH  afeta substrato com grupos ionizáveis; • Estabilidade da enzima: temperatura, força iônica, concentração de substratos ou cofatores da enzima e concentração da enzima, entre outros.

40. Influência do pH • pH 5 e 8 = não afeta a atividade; • Declínio entre pH 6,8-8 e 6,8-5 = forma iônica não adequada; • 5 > pH > 8 = inativação irreversível.

41. Influência da Temperatura •  T  velocidade de reação =  energia cinética; • T muito elevadas = desnaturação da enzima • Rompidas as pontes de hidrogênio  alterações estruturas = nova conformação; • T desnaturação  pouco acima da T ótima.

42. Influência da Temperatura • Enzimas  PM  1 cadeia polipeptídica e pontes dissulfeto = estáveis ao calor; • Efeito da T = pH, força iônica e a presença ou ausência de ligantes; • Substratos protegem a enzima da desnaturação.

43. Influência da Temperatura • K é função  da T  Lei de Arrhenius

44. Influência da Temperatura • Enzimas são termolábeis  reação enzimática = inativação términa • Efeito da T na velocidade das reações  coeficiente de temperatura • Velocidade  quando a T  10ºC.

45. Regulação da Atividade • Sistema enzimático: produto da reação da 1ª enzima  substrato da enzima subseqüente; • Enzimas reguladoras  determina a velocidade da seqüência; • Atividade catalítica  ou   sinais; • Moléculas sinalizadoras  pequenos metabólitos ou cofatores.

46. Enzimas Alostéricas • Ligação não-covalente e reversível  modulador; • Inibição por retroalimentação • Enzima reguladora inibida pelo P final da via  reequilibra as necessidades celulares; • Moduladores: inibidores ou estimuladores.

47. Enzimas Alostéricas • Modulador = substrato  homotrópicas; • Modulador  substrato  heterotrópicas; • Sítio alostérico  específico para o modulador; • Curva de saturação sigmóide  subunidades múltiplas.

48. Enzimas Alostéricas •  curvas de variação de atividade  moduladores inibidores, ativadores ou os dois tipos.

49. Modificação Covalente • Ligação covalente de um grupo químico à sua estrutura; • Metabolismo alterado  aciona vias inativas e inibem vias ativas.