G énmanipuláció ecetmuslicában: P elem technikák

1. Génmanipuláció ecetmuslicában: P elem technikák A P elemek felfedezése, felépítése és mobilitásuk mechanizmusa

2. Nőstény szülő P M normális normális M M Hím szülő diszgenikus normális P P elem függő hibrid diszgenezis Csak M és P törzsek közötti keresztezés okoz hibrid diszgenezist, de csak akkor, ha a hím származik a P törzsből

3. P elemek populációs biológiai megoszlása a Drosophilidaek között • Nem mindegyik faj hordoz P elemeket • A D. melanogaster faj legközelebbi rokonaiban nem mutatható ki P elem • Távolabbi rokon fajok, D.willistoni és D.saltans hordoznak P elemeket • A D.willistoniban talált P elem csak egyetlen bp-ban különbözik a melanogasterben lévőtől. • Ez azt valószínűsíti, hogy a P elemek horizontális transzferrel kerültek át a D.willistoniból a D. melanogasterbe. • A horizontális transzfer mechanizmusa ismeretlen. Legalább 60 milliós evolúciós jelenlét ellenére miért csak mostanában terjedtek el a P elemek a D. Melanogasterben? • D. villistoni Közép- és Dél-Amerikából származik, és még ma is ott endemikus. • D. melanogaster ma egy kozmopolita faj, de Nyugat-Afrikából származik Feltételezik, hogy Amerikába az 1800-as évek elején jutott el. • A horizontális transzfer bármikor bekövetkezhetett azután, hogy a két elterjedési területe átfedett, azonban 1930-as évekig a P elemek még nem árasztották teljesen el a D. melanogaster populációkat A P elemek invázió-szerű elterjedése valószínűleg hatékony transzpozíciós mechanizmusuknak köszönhető.

4. 11 bp IR 11 bp IR ATTAACCCTTA TAAGGGTTAAT A vad típusú P elem felépítése 31 bp IR 31 bp IR CGACGGGACCACCTTATGTTATTTCATCATG CATGATGAAATAACATAAGGTGGTCCCGTCG 2907 31 2877 1 126 136 2763 2773 ORF 1 ORF 3 IR ORF 2 IR ORF 0 1 85 442 501 1168 1222 1947 2138 2706 2907 Intron 1 Intron 2 Intron 3

5. ORF 1 ORF 3 IR ORF 2 IR ORF 0 A P elem által kódolt mRNS-ek és fehérjék ATG TAA TGA UAA AUG AAAA ivarsejt mRNS 87 kD transzpozáz AUG UGA AAAA szomatikus mRNS 66 kD represszor UAA AUG belső deléció AAAA deléciós mRNS 24 kD represszor

6. Foszforilációs helyek GTP-kötő régió Katalitikus régió Dimerizációs domén DNS-kötő domén A P elem transzpozáz fehérje felépítése

7. A P elem transzpozáz • Helyspecifikus DNS-kötő endonukleáz, ami a polinukleotid-transzferázok családjába tartozik. • Mg2+ és GTP kofaktorok szükségesek az aktivitásához. • Specifikus kötőhelye a P elemen végein található 31bp-os és 11 bp-os fordított ismétlődő szekvenciák között található (KD 10-9 M). • Rendkívül magas a nem specifikus DNS-kötő képessége is (KD 10-8 M). • Kötőhelye eltérő távolságra van a két végen található hasító helyektől. • Kötőhelye a P elem 5’-végén átfed a transzpozáz gén promóterében található TATA box-al, ezért az enzim transzkripciós represszorként is működhet. • Csak az 5’- és a 3’-végek egyidejű jelenlétében képes hatékony DNS hasításra. • Hasításának eredményeként 17 bp-os, 3’-túlnyúló ragadós végek képződnek. A 3’ hasítóhely pontosan a P elem végén, míg az 5’ hasítóhely a végtől 17 bp-ra van.

8. IRBP 11bp IR Transzpozáz 31bp IR Transzpozáz kötőhelyek a P elemben 87 IRBP mRNS Transzpozáz 31bp IR P elem promoter 11bp IR 126 136 1 31 48 68 2763 2855 2871 2877 2907 GAAGTATACACTTAAATTCAG CTTCATATGTGAATTTAAGTC 21 bp-ra az 5’ IR végtől 48 68 ATA/CCACTTAA TAT/GGTGAATT konszenzus transzpozáz kötőhely ACGTTAAGTGGATGTCTC TGCAATTCACCTACAGAG 9 bp-ra a 3’ IR végtől 2871 2855

9. A P elem transzpozoszóma felépítése 8 bp-os inszerciós hely duplikáció 3’-vég 5’-vég • A DNS hasítás első lépésében a P elem végek szinapszist alkotnak. • Stabil nukleoprotein komplex jön létre. • A DNS hasítási és javítási reakciók ebben a komplexben játszódnak le. • A komplexet transzpozoszómának nevezzük. 31 bp-os IR szekvencia IRBP 21 bp-os spacer szekvencia 9 10 bp-os Transzpozáz kötőhely transzpozáz P elem

10. NNNNNNNN NNNNNNNN CATGATGAAATAACATA ATACAATAAAGTAGTAC NNNNNNNN NNNNNNNN CCACCTTATGTTATTTCATCATG AGGTGG GGTGGA GTACTACTTTATTGTATTCCACC A P elem kivágódás mechanizmusa 3’ vég 5’ vég Inszerciós hely duplikációja P elem CCACCTTATGTTATTTCATCATG GGTGGAATACAATAAAGTAGTAC CATGATGAAATAACATAAGGTGG GTACTACTTTATTGTATTCCACC NNNNNNNN NNNNNNNN NNNNNNNN NNNNNNNN Inszerciós hely duplikációja 5’ vég 3’ vég P elem

11. A kettősszálú DNS törés javításának modelljei • A DSBR modell szerint szekvencia információ mindkét irányban folyik a templát és a célkromoszómák között. • P elem mobilizáció során a konverzió csak egyirányú: mindig a templátról a célkromoszómára történik. • A Synthesis Dependent Strand Annealing (SDSA) modell jobban leírja a Drosophilában lejátszódó eseményeket: - egyszálú DNS javítást feltételez - DNS szintézis un. buborék vándorlás szerűen játszódik le - nem alakul ki Holliday struktúra

12. A P elem kivágódást követő DNS javítási útvonalak Leánykromatida-függő javítás P elem Homológ kromoszóma-függő javítás P elem Nem homológ végek összetapadása

13. NNNNNNNN NNNNNNNN NNNNNNNN NNNNNNNN NNNNNNNN NNNNNNNN CCACCTTATGTTATTTCATCATG CCACCTTATGTTATTTCATCATG AGGTGG AGGTGG GGTGGA GGTGGA GTACTACTTTATTGTATTCCACC GTACTACTTTATTGTATTCCACC P elem P elem Inszerciós hely duplikációja P elem CCACCTTATGTTATTTCATCATG GGTGGAATACAATAAAGTAGTAC CATGATGAAATAACATAAGGTGG GTACTACTTTATTGTATTCCACC NNNNNNNN NNNNNNNN NNNNNNNN NNNNNNNN Inszerciós hely duplikációja A P elem inszerció mechanizmusa

14. A P elem inszerciós preferenciái Az inszerciós hely szelekciójának pontos mechanizmusa nem ismert, azonban néhány szabályszerűség megfigyelhető: • Inszerciók nem random történnek, bizonyos szekvenciák preferáltak. • Inszerciók gyakrabban fordulnak elő eukromatinban, mint heterokromatinban. • Az eukromatinban un. inszerciós forró pontok találhatók. • Gyakran fordul elő inszerció másik P elemben, vagy annak közvetlen közelében. • Inszerciós gyakoriság nagyobb lokálisan, mint távolabbi régiókban. • Inszerciós gyakoriság nagyobb a nőstény csíravonalban, mint a hímivarsejtekben. • Génen belül inszerciósan preferáltak a nem kódoló 5’-végi szekvenciák. • Az inszerciós hely GC-ben gazdag