Genoma Umano e malattie genetiche lezione 3-4 Martedì 5 Maggio

1. Genoma Umano e malattie genetichelezione 3-4Martedì 5 Maggio

2. le regioni regolative non ci sono molti esempi già studiati il primo classico è quella del locus della  globina una Locus Control Region fa parte di un cluster genetico a livelli superiori mancano degli esempi più chiari potrebbero mancare oppure sono da scoprire

3. regioni regolative con funzione bidirezionale per ora gli esempi più chiari stanno nelle Regioni Regolative costituite da Enhancers questo livello è molto vicino alla attività trascrizionale dei geni che controllano e che costituiscono il cluster genico questo tipo di controllo può essere bidirezionale: TOP - DOWN BOTTOM - UP

4. esempio del cluster delle Ig la risposta immunitaria è data dall’interazione di molte cellule e di molte funzioni collegate con la regolazione dell’espressione delle Ig sono collegate molte altre funzioni che sono coregolate o coordinate il coordinamento deve prevedere: - interazioni intracellulari - “ extracellulari intracellulari: sopravvivenza, selezione, controllo moltiplicativo extracellulari: interazioni con le altre cellule della risposta immune “cross talking” tramite interleukine

5. partiamo da un esempio un sistema piuttosto noto ed interessante la regolazione delle immunoglobuline e dei linfociti B la maturazione e l’attivazione vanno di pari passo sistema multifattoriale esempio di interazione genoma ambiente

6. TOR VERGATA the study of the 3’RR different aspects of the study of a regulatory region interactions of a regulatory region: unidirectional flux ? the jerarchy of the regulation the genome is controlled by epigenetic events interactions of genome and environment these events open the possibility of a non univocal flux needs to be bidirectional

7. TOR VERGATA interactions and jerarchy epigenetic modifications of the region: nucleosome remodeling; methylation

8. TOR VERGATA tools for a RR study the tools : - evolutionary conservation and transformations - polymorphisms in humans (any kind!) - transgenic models in mouse - in vitro assays with cell lines (mouse and human)

9. “La regione regolativa 3’ della catena pesante delle Ig: struttura e funzioni” La tragedia dei linfociti B nati per morire all’ 80% Il 20 % che sopravvive svolge il suo ruolo solo nella vecchiaia (a parte le memory cells che sono minoranza) • - processi di maturazione ed interazioni • cluster delle IgH (heavy) e struttura della regione regolativa • processo evolutivo • instabilità e regioni duplicate • nell’uomo la regione IgH3’RR duplicata • l’enhancer HS1,2-A/B è duplicato e polimorfico • studio dell’attività tramite geni reporter in cellule trasfettate • studio dei fattori che legano la sequenza enhancer EMSA

10. cascata di fosfatasi e kinasi nel processo di maturazione dei linfociti B si verifica una cascata di segnali CD45 Rap 1 MAPKs prima degli eventi di riarrangiamento messo in moto dal preBCR

11. maturazione ANTIGENE INDIPENDENTE ANTIGENE DIPENDENTE Locus Catene leggere V-J processing VJ riarrangiato VJ riarrangiato VDJ riarrangiato. IgM prodotto in membrana. Lo splicing produce anche IgD VDJ riarrangiato. IgM prodotto in membrana Locus Catene pesanti D-J processing V-DJ processing VDJ riarrangiato VDJ riarrangiato CELLULE B Fig. 5A Schema del riarrangiamento delle catene leggere e pesanti dell’immunoglobuline in correlazione con la maturazione dei linfociti B.

12. maturazione II Locus Catene leggere VJ riarrangiato Ipermutazioni somatiche VJ riarrangiato Ipermutazioni somatiche VJ riarrangiato Ipermutazioni somatiche VJ riarrangiato VJ riarrangiato VDJ riarrangiato. Le catene m prodotte in forma di membrana Switch isotipico. Ipermutazione somatica. Catene pesanti prodotte in forma di membrana Switch isotipico a Cg, Ca o Ce. Ipermutazione somatica Switch isotipico. Catene pesanti prodotte in forma secreta. Locus Catene pesanti VDJ riarrangiato Catene m prodotte in forma secreta. CELLULE B Cellule B attivate Centrociti Plasmacellule Cellule Memoria Plasmacellule ANTIGENE DIPENDENTE DIFFERENZAZIONE FINALE Fig. 5B Schema del riarrangiamento delle catene leggere e pesanti dell’immunoglobuline in correlazione con la maturazione dei linfociti B.

13. induzione dello switch PLASMACELLULE Cellule B proliferanti IgG2a o IgG3 IFN-g Cellula B attivata (centroblasto) IgA o IgG2b TNF-b IL-2; IL-4; IL-5; IL-4 IgE o IgG1 Citokine proliferanti: IL-2; IL-4; IL-5; IL-2; IL-4; IL-5; IgM Citokine per il differenzamento: IL-2; IL-4; IL-5; IFN-g; TNF-b; Fig. Azione delle citochine sulla ricombinazione class switching (CSR) cellule denditriche e T-helper

14. ricombinazione VH DH JH CH Ricombinazione V(D)J Switch region: V(D)J m d g3 g1 2b 2a e a • Consiste di sequenze ripetute tra 1 e 10 kb Ricombinazione class switching (CSR) IgM • Il filamento non stampo è ricco in G 2a m V(D)J e a • Sm, Sa ed Se hanno un repeat di 5 bp. Sg ha un repeat di 49 bp. d 2b IgE g3 g1 Risultato dello switch Circolo exciso Fig. Ricombinazione class switching (CSR) nel topo.

15. mappe dei loci IgH e IgL LOCI DELLE CATENE PESANTI E LEGGERE DELL’Ig Locus catena leggera l Cromosoma 22 Locus catena leggera k Cromosoma 2 Locus catena pesante Cromosoma 14

16. il riarrangiamento Trascrizione regione S A B C D E F AID? AID? CSR ricombinasi? Modifica l’RNA e/o le strutture del DNA delle regioni S accessibili RNA editing ? Riconoscimento delle regioni S accessibili Formazione di strutture secondarie (R loop?) A A C C D F D F E E B B Formazione di breaks al DNA CSR ricombinasi? Attivazione dei sistemi di riparazione del DNA A C A C B Riparazione dei breaks B AID? AID? una regione S Switch su un altro cromosoma due regioni S c-myc S S S S A A B C A B E F traslocazione Delezioni intra-switch Class switching recombination 2 1 Modelli che spiegano la Ricombinazione class switching (CSR). Activation-induced cytidine deaminase (AID)

17. Sviluppo dei linfociti B indipendente dall’ antigene pro-B “committed” esprimono B220 (CD45) e anche CD 43, TdT terminal deossitransferasi, RAG-1, RAG-2, CD19 pre-B diminuzione di CD43, RAG-1 e 2, scomparsa di TdT, riarrangiamento della catena pesante, pBCR pre B cell receptor, riarrangiamento produttivo della catena leggera espressione di membrana di IgM Trascrizione dei surrogati delle catene leggere  Ig / formano il pre-B cell receptor complex di membrana essenziale per le fasi di sviluppo (CD45 - B220 - fosfotirosin fosfatasi PTPase integra i segnali durante lo sviluppo, non necessario per la linfopoiesi, forse è un’attività ridondante) CD19 interagisce con le tirosin-kinasi, non è essenziale, però favorisce l’entrata nel circolo periferico espressione nelle  fasi di sviluppo

18. maturazione nel germinal center avviene in associazione intima con cellule THelper e cellule dendritiche del follicolo : -proliferazione clonale -ipermutazioni somatiche -selezione di affinità (self ed altro) -selezione negativa -switch isotipico

19. strutture regolative della trascrizione e indirettamente del riarrangiamento delle IgH • promotori dei geni V • enhancer intronico iE • ECS (evoluz. conserved seq.) intervening 5’ CH genes • 3’ Ig heavy 3’ enhancer complex o regulat. region • k intronico iE • 3’E •  light chain E • si attivano per la trascrizione sterile insieme a RAG1/2 con altri enzimi del riparo, variazione di metilazione e di struttura cromatinica, • gli enhancers necessari anche per la ricombinazione V(D)J I riarrangiamenti sono regolati da fattori di trascrizione ubiquitari e tessuto specifico

20. evoluzione delle Ig Cluster organization: Sharks (hom shark)- multiple loci of each type except IgMgj IgM IgNAR IgW IgM1gj (V DDJ Cm)200 (V DDDJ NAR)>2 (V DD J C)<10 (VD J Cm1gj)<10 (multiple chromosomes) (not L chain-associated) Translocon organization: Cm 9J’s teleostei Channel catfish (700 - 800kb) many V’s VDJ D,J’s 100-200 V’s D’s Cm Cdsec Cdmem IgM lungfish dipnoi several V’s D, J’s Cm several V’s D, J’s C Presumptive arrangement IgM IgW coelacanths crossopterigi (latimera) VD’s(>100) J’s C VD’s(>100) J’s Cm IgM IgY IgX Xenopus (~800 kb) V’s(100-200) D(>15) J(8-9) Cm C  C  Sm S S ? 48 kb (duck); 80kb (chicken) Duch and chicken pseudoV’s(~100) V D’s J Sm Cm C a Sa S C  Transcriptional orientation 150 kb (cattle) J(2) 7 geni costanti Cattle E V’s(~15) D(>3) Sm Cm Sd Cd Sg3 Cg3 Sg1 Cg1 Sg2 Cg2 Se Ce Sa Ca 13 Ca genes J(6) E Rabbit forse 13 geni costanti E V’s(~100) D(14) Sm Cm Sg Cg Se Ce Sa Ca Sa Ca Sa Ca Sa Ca Sa Ca Sa Ca J(4) 200 kb 8 geni costanti E Mouse E V’s(~100) D(14) Sm Cm Cd S Cg3 S Cg1 SCg2b SCg2a SCe SCa J(6) 350 kb 10 geni costanti Human E E V’s(~100) D(27) Sm Cm Cd S Cg3 S Cg1 S SCa1 S Cg2 S Cg4 SCe SCa2

21. cluster Ig topo-uomo mta1 crip2 crip1 hole a e g2a g2b g1 g3 d m J D V Mouse Igh cluster Chromosome 12 Em hs 1,2 hs 3A mta1 trascrizione hs 4 hs 3B JDV 12F1 BAC199M11(AF450245) mta1 crip2 crip1 hole a2 e g4 g2 g a1 e g1 g3 d m J D V Human Igh cluster Chromosome 14 Em hs 1,2 hs 3 hs 1,2 hs 3 mta1 hs 4 hs 4 JDV 14q32.33 3’a2 3’a1 g hs4 hs1.2 hs3 20bp a1 elk 2.1 3’a1 86,035,000 86,040,000 86,045,000 86,050,000 86,055,000 86,060,000 86,065,000 86,070,000 86,075,000 hole elk 2.2 hs4 hs1.2 hs3 a2 20bp 3’a2 85,894,500 85,904,500 85,914,500 85,924,500 85,934,500 85,944,500 85,954,500 centromero telomero (rischio riarrangiamenti) IgH3’RR-A IgH3’RR-B