Réactions complexes, en plusieurs étapes:

1. Réactions complexes, en plusieurs étapes: Compatibles avec l’équation de Michaelis et Menten?

3. E  EA  (EAB  EPQ)  EQ  E Calcul de la vitesse de réaction à l’état stationnaire: • A l’état stationnaire, par définition: • d(EA)/dt = 0 = k1 [E][A] + k-2 [EAB]-k-1[EA]-k2[EA][B] • d(EAB-EPQ)/dt = 0 = k2 [EA][B]+k-3[EQ][P]-k-2[EAB-EPQ]-k3[EAB-EPQ] • d(EQ)/dt = 0 = k3[EPQ]+k-4[E][Q]-k-3[EQ][P]-k4[EQ] • d(E)/dt = 0 = k-1[EA] ]+k4[EQ] -k1[E][A]-k-4[E][Q] • Loi de conservation des masses:E + EA + EAB/EPQ + EQ = Etot • Loi d’action des masses: à l’état stationnaire, • v = k1[A]∙[E] = k2[EA] = k3[EAB/EPQ] = k4[EQ]

4. Résolution: • Système de n équations à n inconnues: résolution par le système des déterminants… Laborieux! Méthodes « simplifiées »: La méthode de King et Altman est la plus simple pour le calcul du dénominateur de l’équation représentant la vitesse, v = Vmax[ES]/[Etot]; La méthode de Wong et Hanes est plus efficace pour le calcul du numérateur (aucune simplification de termes superflus n’est nécessaire).

5. Dénominateur: King et Altman Recherche de l’équation, Analyse « topologique » des mécanismes d’inhibition par produit

6. But du jeu: 1. décrire la vitesse de réaction par une équation de la forme « Michaelis-Menten », c’est à dire 2. Distinguer les différents mécanismes réactionnels 3. Prévoir le mode d’inhibition par des analogues des différents produits de la réaction (compétitif, non compétitif, etc.)

7. Calcul de [Etot] : la méthode de King - Altman Posons: • La concentration de chacune des formes enzymatiques ([E], [ES], [EP], etc) est proportionnelle à la vitesseà laquelle elle s’accumule • La concentration totale en enzyme est proportionnelle à la somme des concentrations de toutes les formes possibles ([Etot]=[E]+[ES]+[EP]+etc) • Si on divise [ES] par [Etot], les constantes de proportionnalité vont s’annuler…

8. Méthode Graphique: • Remplacer le schéma réactionnel par 1 ou plusieurs cycles fermés: • Dessiner tous les patrons qui • Consistent uniquement de lignes du « patron maître » • Connectent toutes les formes enzymatiques • Ne contiennent aucun cycle fermé • Chercher puis additionner toutes les combinaisons de réactions qui conduisent à chaque forme enzymatique, pour obtenir leurs vitesses de formation. • Additionner les vitesses de formation de toutes les formes enzymatiques pour obtenir « Etot ».

9. Remplacer le schéma réactionnel A A k1A E EA k-1 Q B Q ou k4 k-4Q k-2 k2B B « Master pattern » (patron maître) k-3P EQ k3 P P par 1 ou plusieurs cycles fermés: EAB/EPQ Attention:Toutes les constantes cinétiques doivent être de premier ordre (k-1, etc.) ou de ‘pseudo premier ordre’ (k1[A], etc.)!

10. NON 2) Dessiner tous les patrons qui - Consistent uniquement de lignes du « patron maître » • - Connectent toutes les formes enzymatiques entre elles - Ne contiennent aucun cycle fermé OUI:

11. k-1 k-1 k-1 E E E E k2B k-2 k4 k4 k-2 k4 k-3P k3 k3 3) Chercher toutes les combinaisons de réactions qui conduisent à chaque forme enzymatique. Par exemple : les réactions conduisant à « E » sont:

13. Si on groupe tous les facteurs indépendants, tous les multiplicateurs de [A], etc: le dénominateur devient équivalent à la somme:

14. Recherche du numérateur : méthode de Wong et Hanes

15. Recherche du numérateur :méthode de Wong et Hanes Rechercher tous les schémas qui • Consistent uniquement en lignes du schéma directeur • Connectent toutes les formes d’enzyme • Contiennent uneflèchepartant de chaque enzyme • Contiennent exactement un cycle complet, fermé

16. A A k1 E EA k-1 Q Q B B  k4 k-4 k2 k-2 k-3 EQ EAB/EPQ k3 P P Le numérateur est la somme algébrique du produit des vitesses du cycle, avec une valeur positive pour le cycle « forward » et une valeur négative pour le cycle « reverse »

17. Equation de forme « Michaelis Menten »? Définition des Vmax, KM et Ki

18. Nous voulions obtenir une équation de la forme: • Nous venons d’obtenir une équation de la forme:

19. Pour y arriver: définitions des Vmax , KM et Ki

20. Il « suffit » de choisir la définition qui convient le mieux pour simplifier l’équation de la vitesse:

21. On obtient une équation du type: Expérimentalement: on varie un seul substrat à la fois: par exemple, [A].

22. Si on divise Numérateur et Dénominateur par les termes indépendants de [A]:

23. diminue avec les termes indépendants de [A] (reflétant les complexes incapables de reconnaître A) diminue avec les termes qui multiplient [A] (reflétant les complexes EAP non productifs) augmente avec les termes indépendants de [A] et diminue avec les termes qui multiplient [A]

24. Rappel: cinétique Michaelienne Michaelis Menten - un substrat, un inhibiteur: Nous avons vu que si il y a • Formation de EI, pas ESI: compétitif • Formation de ESI, pas EI: incompétitif • Formation de EI et ESI : mixte ou non-compétitif

25. Inhibition par produits • L’inhibition par produits dépend à la fois du substrat et du produit considéré. • Termes en [S]…[P]… : formation de complexes ESI: Vmax apparente diminue en présence de P (inhibition mixte); • Termes en [P]… (pas [S]) : formation de EI : KS apparentediminue • KM = Vmax/KS: si termes [P]… mais pas [S]…[P]… : KM augmente; P inhibiteur compétitif.

26. Le type d’inhibition par produit peut servir à identifier le mécanisme! Tableau extrait de « Enzyme kinetics » de I. Segel (Wiley and sons, 1975): Etc., etc., etc….

27. Exemple: réaction réversible uni-bi ordonnée : • ordonnée: • Enzyme + S   ES   EQ + P   E + Q + P • 2. aléatoire: • EQ + P   E + Q + P • Enzyme + S   ES   • EP + Q   E + Q + P

28. 1. Uni-bi ordonnée: EA/EPQ A P EQ E Q Schémas à prendre en compte: dénominateur numérateur

29. A P A P Q Q

31. Définitions des Ki? ad hoc:

32. Définitions des Ki? ad hoc:

33. Conclusion: • Terme en « P » : Ks diminue • Terme en « AP »: Vmax diminue • KM = Vmax/KS change: P = mixte • Terme en « Q », pas « AQ »: Vmax constant et KS diminue donc KM augmente et Q = compétitif

34. NADH E E∙NADH NAD+ Pyruvate E∙NAD+ E∙NADH∙Pyruvate/Lactate∙NAD+ Lactate Exemple: réaction bi-bi ordonnée Est équivalent à:

35. A E E∙A Q B E∙AB/PQ E∙Q P

36. Expérience: incubation avec les 2 substrats et un seul produit (soit P soit Q)

37. Termes P , AP, ABP : • P = inhibiteur mixte vis-à-vis de A et vis-à-vis de B • Termes Q et BQ, pas AQ : • Q = inhibiteur mixte vis-à-vis de B, • Q = inhibiteur compétitif vis-à-vis de A • Si A saturant: tous les termes qui ne contiennent pas « A » vont disparaître (trop petits comparés aux autres). Il reste : • Termes (A)P et (A)BP donc P reste inh. mixte vis-à-vis B; • Pas de termes AQ, donc levée d’inhibition par Q • Si B saturant: même raisonnement • Termes A(B)P mais pas (B)P donc P devient incompétitif vis-à-vis de A • Termes (B)Q donc Q reste compétitif vis-à-vis A

38. Réaction bi-bi ordonnée

39. Réaction uni-uni,uni-uni « ping pong »

40. Termes P, AP, pas BP : • P = inhibiteur mixte vis-à-vis de A, compétitif vis-à-vis de B • Termes Q, BQ, pas AQ : • Q = inhibiteur mixte ou non compétitif vis-à-vis de B, compétitif vis-à-vis de A • Si A saturant: • Termes AP donc P reste compétitif vis-à-vis B; pas termes AQ donc l’inhibition par Q est levée • Si B saturant: • Pas termes BP donc l’inhibition par P est levée; termes BQ donc Q reste compétitif vis-à-vis A

42. Mécanismes complexes: • Si deux ou plusieurs réactions conduisant au même résultat: il suffit d’additionner les vitesses de ces réactions • Si deux voies alternatives coexistent: additionner tous les schémas possibles ne contenant pas de cycles fermés • Deux réactions conduisant au même résultat: grouper les réactions équivalentes en introduisant des facteurs statistiques • Cycles alternatifs (par exemple: 2 substrats2 produits): Multiplier la vitesse des réactions qui quittent le point de contact par la vitesse des réactions qui y arrivent • Si plusieurs états de l’enzyme sont à l’équilibre pendant la réaction, il suffit d’utiliser des constantes de vitesse pondérées

43. k1A k-1 EA=EP E k-2P k2 Enzyme Michaelienne:

44. Mécanismes complexes: • Si deux ou plusieurs réactions conduisant au même résultat: il suffit d’additionner les vitesses de ces réactions • Si deux voies alternatives coexistent: additionner tous les schémas possibles ne contenant pas de cycles fermés • Deux réactions conduisant au même résultat: grouper les réactions équivalentes en introduisant des facteurs statistiques • Cycles alternatifs (par exemple: 2 substrats2 produits): Multiplier la vitesse des réactions qui quittent le point de contact par la vitesse des réactions qui y arrivent • Si plusieurs états de l’enzyme sont à l’équilibre pendant la réaction, il suffit d’utiliser des constantes de vitesse pondérées

45.  15 schémas possibles contenant (n-1) lignes (n étant le nombre de formes enzymatiques), mais 4 sont éliminés car au moins 1 cycle fermé)

46. Mécanismes complexes: • Si deux ou plusieurs réactions conduisant au même résultat: il suffit d’additionner les vitesses de ces réactions • Si deux voies alternatives coexistent: additionner tous les schémas possibles ne contenant pas de cycles fermés • Deux réactions conduisant au même résultat: grouper les réactions équivalentes en introduisant des facteurs statistiques • Cycles alternatifs (par exemple: 2 substrats2 produits): Multiplier la vitesse des réactions qui quittent le point de contact par la vitesse des réactions qui y arrivent • Si plusieurs états de l’enzyme sont à l’équilibre pendant la réaction, il suffit d’utiliser des constantes de vitesse pondérées

47. k2P 2k2P k1A 2k1A k-1 2k-1 2k-3 k1A k-1 k3A k-3 k4P 2k3A 2k4P k2P Est équivalent à: k3A k-3 k4P

49. Mécanismes complexes: • Si deux ou plusieurs réactions conduisant au même résultat: il suffit d’additionner les vitesses de ces réactions • Si deux voies alternatives coexistent: additionner tous les schémas possibles ne contenant pas de cycles fermés • Deux réactions conduisant au même résultat: grouper les réactions équivalentes en introduisant des facteurs statistiques • Cycles alternatifs (par exemple: 2 substrats2 produits): Multiplier la vitesse des réactions qui quittent le point de contact par la vitesse des réactions qui y arrivent • Si plusieurs états de l’enzyme sont à l’équilibre pendant la réaction, il suffit d’utiliser des constantes de vitesse pondérées

50. + + EA EB E EQ EP