第六节 动物 胚胎干细胞的分离培养技术 Embryonic Stem cells （ ES cells ）

1. 第六节 动物 胚胎干细胞的分离培养技术 Embryonic Stem cells（ES cells） 一、概述 二、胚胎干细胞研究的意义 三、胚胎干细胞研究的历史 四、胚胎干细胞分离培养的基本程序 五、胚胎干细胞技术目前存在的问题和发展远景

2. 第六节 胚胎干细胞技术 Embryonic Stem cells (ES cells) 一、概述 • 哺乳动物胚胎干细胞（embryonic stem cells, ES细胞） 一般是指从早期胚胎经体外分化抑制培养分离出来的具有全能性的细胞。 • ES细胞是由Evans和Kauf-man1981年首次从延迟小鼠囊胚中分离出来的多能性细胞，当时称之为EK细胞。以后称之为胚胎干细胞。

3. 人胚胎干细胞分离技术途径 PGCs ICM

4. ES细胞的特点： • ES细胞具有胚胎细胞的特性，在形态上表现为体积小、核大，核仁突出，培养时呈克隆状生长；在功能上，ES细胞具有发育的全能性，即具有分化为成年动物体内任何一种细胞类型的能力。 • ES细胞具有细胞系的特征，在饲养层上能维持未分化状态并实现自我更新。因为可无限增殖，也可冷冻保存。

5. 二、胚胎干细胞研究的意义 • ES细胞在哺乳动物个体发生发育规律的研究中极有价值的工具； • ES细胞是研究细胞分化的理想手段；图 • ES细胞是研究基因功能的首选细胞； • Es细胞作为生产转基因动物的主要途径之一； • ES细胞治疗技术将引起一场医学革命； • ES细胞可用于研究细胞癌变机理和新药物的筛选。

6. 1、1981年 Evans 和 Kaufman 获得小鼠ES细胞系 2、1988年 Doetschman获得仓鼠ES细胞系 3、1994年 Wheeler 和Robert获得猪ES细胞系 4、1998年 Thomson获得人的ES细胞系 5、 2007年 日本的Yamanaka研究小组和美国的James Thomson 研究小组分别获得诱导多能性干 细胞 （induced pluripotent stem cell，iPS 细胞） • 二、胚胎干细胞研究的历史

7. 四、胚胎干细胞分离培养的基本程序 • (一)选择抑制细胞分化的培养体系 • 1、饲养层培养体系 • 2、条件培养体系 • 3、培养液中添加分化抑制因子体系

8. 四、胚胎干细胞分离培养的基本程序 • （二）早期胚胎的选择 • （三）胚胎干细胞的分离 • （四）胚胎干细胞的保持 • （五）胚胎干细胞的鉴定 • （六）胚胎干细胞的分化潜力验证

9. 五、胚胎干细胞技术目前存在的问题和发展远景五、胚胎干细胞技术目前存在的问题和发展远景 • 1、根据细胞的分化特点建立更有效的培养体系 • 2、加强胚胎干细胞体外诱导分化研究 • 3、提高家畜胚胎干细胞的分离水平 • 4、加速胚胎干细胞在医学上的应用

10. 第七节 嵌合体 Chimera 嵌合体动物：指由2个以上不同的受精卵或3个以上的配子相结合，有不同基因型的细胞群所构成的复合体。 嵌合体动物制作方法： 1、集合（凝集）法：在卵裂阶段使2个以上的胚胎发生粘着和结合。 2、注入法：在临近着床的胚泡期，用显微操作方法将另一个体的细胞注入到囊胚腔中。

11. 研究现状： 家畜的嵌合体不但已在个体间和品种间取得成功（绵羊、牛等），而且在异种间也得到了活的后代，如绵山羊人工嵌合体，该技术对遗传学研究具有重要意义，塑造特异性状的新奇物种，从而为动物园展示了新的前景，嵌合体也被用来研究免疫学系统的机理。

12. 哺乳动物嵌合体生产基本方法示意图 1 2

13. 小鼠胚胎囊胚腔注入嵌合法

14. 嵌合体猪 • Female piglet 6899 developed from a Duroc-Pietrain blastocyst (red and black pigmentation) injected with German Land-race PGCs (white pigmentation on head and legs). • (B) Chimeric piglets 7003 (male) and 7006 (female) with red areas across the back developed from ‘‘red’’ Duroc cells injected into Landrace blastocysts.

15. 利用胚胎聚合和类胚胎干细胞制备嵌合体牛 四细胞期胚胎与类干细胞聚合后，培养成为桑椹胚和囊胚，移植后生出嵌合体牛犊。