Genética Molecular, laboratorios. Laboratorio 007 Patricia Agostino pagostino@gmail

1. Genética Molecular, laboratorios. Laboratorio 007 Patricia Agostino pagostino@gmail.com Turno noche: 18 hs (puntual)

2. Genética Molecular, laboratorios. Extracción de ADN de tejidos humanos Uds. y sus familiares Amplificación por PCR y análisis de RFLP ADN mitocondrial ADN nuclear Gen Amelogenina Identificación sexual Deleciones en el cromosoma Y Herencia Materna Total: 5 trabajos prácticos

3. TP 1: Extracción de ADN a partir de muestras de mucosa bucal Se realizará la técnica de extracción y procesamiento de ADN humano para su posterior amplificación utilizando la técnica de PCR (reacción en cadena de la polimerasa). Extracción con cloroformo-isoamílico. Semi-cuantificación mediante electroforesis en gel de agarosa. 2 clases

4. TP 2: Caracterización del sexo mediante la amplificación por PCR del gen de amelogenina. El gen de amelogenina (AMG) codifica para una proteína del esmalte dental, y se encuentra en ambos cromosomas sexuales. La secuencia de este gen en el cromosoma Y se diferencia de la del X por una deleción de aproximadamente 200 pb, por lo que la visualización del producto de PCR permitirá distinguir las muestras provenientes de mujeres de aquéllas provenientes de varones. XY Amplificación de AMG por PCR. Resolución en gel de agarosa 2% XX 2 clases

5. TPs 3 y 4: Detección de RFLPs (Restriction Fragment Lenght Polymorphisms) mediante la amplificación por PCR de un fragmento de ADN mitocondrial. Se realizará la amplificación por PCR de una región del ADN mitocondrial de 312 pb y su posterior digestión enzimática para poder visualizar el patrón de RFLPs característico de cada muestra. Amplificación por PCR fragmento ADNmit Digestión con enzima MnlI Visualización patrones RFLP 3 clases (Exp papers la 3º clase)

6. TP 5: Detección de deleciones en el cromosoma Y asociadas con infertilidad masculina. Existen grandes regiones en el cromosoma Y asociadas con la producción de células espermáticas, conocidas como AZF (azoospermia factor). Deleciones en algunas de estas regiones se asocian a infertilidad masculina. Se utilizarán los conceptos aprendidos (como PCR multiplex) para el estudio de microdeleciones correspondientes a la región de los genes AZF y su correlación con infertilidad y cáncer testicular. Clase teórica. 1 clase

7. Forma de evaluación. Trabajos prácticos: • 80% de asistencia y aprobación de parcialitos • Informe de TPs • Exposición de trabajos • Examen de TPs REGIMEN DE ESTUDIOS DE LA UNQ http://www.unq.edu.ar/advf/documentos/5006e6bcefbf8.pdf ARTICULO 11°: Se considerará ausente a aquel alumno que no se haya presentado a las instancias de evaluación pautadas en el Programa de la asignatura.

8. GENETICA MOLECULAR Clase de extracción de ADN

9. Extracción de ADN Punto de partida para una multitud de análisis genéticos Investigación Casos Medicina Forense Paternidad Enfermedades Hereditarias Criminalística

10. Hay más de un tipo de ADN ADN nuclear ADN cloroplástico en plantas ADN mitocondrial ADN plasmídico, ADN viral

11. Clasificación según su distribución ADN nuclear 22 autosomas + X, Y 3.000 millones pares de bases 1 molécula/célula ADN mitocondrial 16.569 pares de bases 2 a 10 moléculas de ADNmt/mitocondria 500 a 1.000 mitocondrias /célula 1.000 a 10.000 moléculas ADNmt/célula Carece de histonas

12. Clasificación según su patrón de herencia • Herencia biparental: Autosomas, cromosoma X • Herencia uniparental: ADN mitocondrial, cromosoma Y

13. Fuentes de ADN Muestras Forenses Diferentes Tejidos Líquida Manchas secas Pelo -del bulbo capilar -sin bulbo: ADNmt Uñas -células epiteliales- Colillas de Cigarrillos (restos de células) Huesos Dientes Momias Sangre Tejidos embebidos en parafina Fluidos corporales Saliva – Semen-Orina Células en Cultivo Animales - Plantas Hongos - Levaduras Bacterias-Virus

14. Objetivo de una buena extracción Cantidad Calidad (integridad) Pureza (ausencia de contaminaciones)

15. Técnicas de biología molecular que utilizan ADN ADN "Southern blot" PCR Secuenciación

16. Método de extracción de ADN genómico (alto peso molecular) Pre-tratamiento(en caso de ser necesario) Neutralización Tratamiento con solventes orgánicos Lisis celular Disrupción mecánica Agentes químicos Purificación de ADN Precipitación Matrices (kits comerciales)

17. Pre-tratamiento Tratamiento con solventes orgánicos Muestras de tejidos fijados e incluidos en parafina Sucesivos lavados con xileno Lavados con Etanol absoluto Calor Xileno

18. Lisis celular Métodos físicos  Disrupción mecánica • Homogeneizadores • Tijeras • Sonicación Agentes químicos  Detergentes: SDS (sodium dodecyl sulfate), CTAB (hexadecyltrimethylammonium bromide)  EDTA: quelante iones  Digestión enzimática: Proteinasa K  Otras: RNAsas, Amilasas, etc

19. Purificación de ADN Agregado de sales LiCl, NaCl, NaClO4 Fenol-cloroformo SEVAG: Isoamílico-Cloroformo Extracción orgánica, separación de fases ADN Moléculas bipolares Proteínas, restos de membranas, lípidos

20. Purificación de ADN Precipitación Lavados con alcoholes de menor grado ADN + ETOH o Centrifu- gación Isopropanol Dilución en buffer TE o H2O

21. Kits comerciales Columnas con Matríz de Sílica Las columnas unen selectivamente el ADN, en presencia de sales caotrópicas. El ADN es recuperado a partir de la matriz de sílica mediante lavado con TE o agua.

22. Tarjetas FTA-Whatman Papel de filtro especialmente impregnado: Muestras: sangre, saliva u otros fluidos corporales. Provoca: lisis celular, inactivación enzimática, bacteriana y viral PCR sobre el papel: FTA-purification reagent: elimina fácilmente los inhibidores de la PCR. El DNA queda atrapado y estabilizado en la matríz permitiendo realizar la PCR sobre el mismo. Fácil Transporte y Almacenamiento Pueden conservarse a temp. ambiente indefinidamente en condiciones de sequedad.

23. Selección del método Tipo de muestra Capacidades del laboratorio Target a detectar Cantidad de muestras Grado de pureza Facilidades Repetitividad Cantidad de ADN Rendimiento Aplicaciones Tiempo de análisis Integridad Presencia de inhibidores Costos

24. Visualización y cuantificación de los resultados ¿ Qué Cantidad y Calidad obtenemos ? Fluorometría 3 Metodologías Fluorómetro (ej: QubitTM) Espectrofotometría Gel Cuantificación por fluorocromo • Cuantificación Abs 260 nm • Pureza Rel. Abs 260 nm / Abs 280nm • Semi-cuantificación Standard de cuantificación • Calidad  Degradación PM del ADN

25. Visualización en gel de agarosa Extracción de ADN genómico Resultado esperado en un laboratorio de investigación Resultado esperado en una clase de TP A B C D E A B C D E Ladder Ladder

26. Visualización en gel de agarosa Semi-cuantificación de ADN

27. Visualización en gel de agarosa Extracción Parafina Extracción Fenol - Cloroformo

28. Extracción con LiCl a partir de muestras de saliva G8

29. Extracción de RNA Consideraciones especiales: • RNAsas (uso de inhibidores de RNAsas) • pH (pH 5-6 para RNA, pH 8 para DNA)

30. Tipos principales de RNA en la célula • RNA mensajero (mRNA):  1-5% (sirve como molde para la síntesis de proteinas) • RNA ribosomal (rRNA):  80% (componente estructural de los ribosomas) • RNA de transferencia (tRNA):  10-15% (participa en la síntesis de proteínas)

31. ¿Para qué extraer RNA? • Tamaño (estudiar distintas formas de splicing) • Secuencia (predecir un producto proteico) • Abundancia (medir los niveles de expresión) • Dinámica de expresión (temporal, tejido-específica, etc).

32. Protocolos de extracción de RNA Extracción orgánica (solventes orgánicos) Extracción por afinidad (columnas) Extracción con oligo(dT) (para mRNA)

33. Visualización de RNA en gel • Geles desnaturalizantes • Condiciones libres de RNAsas

34. Resumen Vimos: • Tipos de ADN • Fuentes de ADN • Técnicas moleculares que utilizan ADN • Protocolos de extracción de ADN • Visualización y cuantificación de ADN • Extracción de ARN

35. ¿Preguntas?