Fundamentos de Engenharia Genética

1. Fundamentos de Engenharia Genética Biologia 12º ano

2. Dogma Central da Biologia Molecular

3. O que é Engenharia Genética? • É a modificação de seres vivos pela manipulação directa do DNA, através da inserção ou delecção de fragmentos específicos. A sua aplicação inclui a produção de vacinas, proteínas por microorganismos, alimentos, transplantes, terapia génica, animais transgénicos. • Também conhecida como Tecnologia do DNA Recombinante • Inclui o isolamento, cópia e multiplicação de genes, recombinação de genes, ou DNA de diferentes espécies, e transferência de genes de uma espécie para outra, contornando o processo reprodutivo

4. Exemplos de aplicações • Na produção de insulina humana através do uso modificado de bactérias e na produção de novos tipos de ratos como o OncoMouse (rato cancro) para pesquisa, através de manipulação genética. Uma vez que uma proteína é codificada por um segmento específico de ADN chamado gene, versões futuras podem ser modificadas mudando o ADN de um gene. Uma maneira de fazê-lo é isolando o pedaço de ADN contendo o gene, cortando-o com precisão, e reintroduzindo o gene em um segmento de ADN diferente.

5. A insulina facilita a entrada da glicose nas células (onde ela será utilizada para a produção de energia) e o armazenamento no fígado, na forma de glicogênio. Retira o excesso de glicose do sangue. Isso ocorre, logo após as refeições, quando a taxa de açúcar sobe no sangue. A falta ou a baixa produção de insulina provoca diabetes, doença caracterizada pelo excesso de glicose no sangue (hiperglicemia).

6. História da engenharia genética 1930 - Dois pesquisadores norte-americanos demonstraram a regulação pelos genes da produção de proteínas e enzimas e a consequente intervenção nas reacções dos organismos dos animais. A partir destas pesquisas, teve início o progresso de descoberta da estrutura genética humana. 1944 – Na pesquisa da cadeia molecular do ácido desoxirribonucleico (DNA), ou (RNA), descobriu-se que este é o componente cromossômico que transmite informações genéticas. 1953 – Conseguiu-se mapear boa parte da estrutura da molécula do DNA.

7. 1961 – Foi descoberto que o principal responsável pela síntese proteica é o DNA e passou então a ser o elemento central das pesquisas de engenharia genética. 1972 – Ligaram-se duas cadeias de DNA. Uma era de origem animal, a outra bacteriana. Esta foi a primeira experiência bem sucedida onde foram ligadas duas cadeias genéticas diferentes, e que é considerada por muitos autores o início da criação sintética de produtos de engenharia genética.

8. 1978 - O suíço Werner Arber e os norte americanos Daniel Nathans e Hamilton O. Smith foram laureados com o Prêmio Nobel de medicina ou fisiologia por terem isolado as enzimas de restrição que são substâncias capazes de quebrar o DNA controladamente em pontos precisos. Juntamente com a Ligase que consegue unir fragmentos de ADN, as enzimas de restrição formaram a base inicial da tecnologia do DNA recombinante.

9. Era da manipulação genética • Iniciou-se, então, a era da manipulação de mensagens genéticas, expressas em fragmentos de sequências que compõem o código genético e os nucleotídeos. • A partir deste momento a engenharia genética passou a modificar as moléculas de DNA, utilizando enzimas específicas. As ligases, enzimas que agem para unir a cadeia fragmentada, começaram a ser descobertas e sintetizadas para manipulação genética.

10. Para obter um pedaço de DNA, é preciso “cortar” o fragmento da molécula e, em seguida, colar suas extremidades. Para cortar os pedaços de DNA, são utilizadas as enzimas de restrição e, para se ligar os fragmentos de DNA, são utilizadas as enzimas de ligação ou ligase.

11. Enzimas de Restrição • São endonucleases que clivam o DNA em sequências específicas chamadas locais de restrição. • Quebram a ligação fosfodiéster. • Os locais de restrição são, geralmente, sequências palindrómicas (mesma sequência de nucleótidos, mas de polaridade inversa).

12. Enzymes for DNA manipulation – restriction enzymes

13. EcoRI metilase Enzimas de Restrição • Endonucleases específicas isoladas de procariontes. • Protegem a bactéria do ataque de vírus (fagos). • Protegem seu próprio DNA metilando-o no local de restrição. • Enzimas do tipo II são as mais utilizadas em Biologia Molecular.

14. Os Vectores São moléculas de DNA que irão propagar o DNA clonado. • Características desejadas: • Habilidade de se duplicar na célula hospedeira; • Marca genética para selecionar a célula contendo o vector (resistência a drogas ou marcas auxotróficas); • Locais de clonagem únicos.

15. Clonagem de Genes Clonagem de um gene ou de qualquer fragmento de ADN ocorre da seguinte forma: a) O gene é ligado a um vector, formando um DNA recombinante. b) Esta molécula é introduzida numa célula hospedeira (bactéria) onde permanece num estado epissomal (não integrado no genoma do hospedeiro). c) Vector tem a capacidade de se replicar autonomamente. d) À medida que a célula hospedeira se vai dividindo, o vector recombinante também se divide e é transmitido às células-filhas, formando-se um clone de células iguais.

16. Clonagem em E. coli utilizando plasmídeo vector

17. Objectivos da clonagem

18. Tipos de vectores • Plasmídios • Bacteriófagos (fagos) • Cosmídios • Cromossomos artificiais de levedura (YAC) • Vectores especiais para plantas, células de insetos e mamíferos

19. Plasmídios • Moléculas de DNA fita dupla circulares e de replicação autónoma (ORI); • Têm marcas de selecção para resistência a antibióticos.

20. Caixa de Petri com colónias bacterianas brancas - significa a presença de DNA recombinante no plasmídio.

21. Bacteriófagos • Infectam células de E. coli e o DNA duplica-se na célula hospedeira. • Ex: Fago  O Ciclo de vida de um bacteriófago

22. Clonagem no Fago λ

23. Utilização da tecnologia do DNA recombinante Substância obtida pela tecnologia do rDNA Aplicação Hormona do crescimento Disfunção hipofisária Factor de crescimento da pele Processos de cicatrização da pele Interferão Cancro Factores de coagulação VII, VIII e IX Hemofilia Vacina para a hepatite Hepatite B Teste da SIDA Despiste da SIDA Superóxidodismutase Evita a extensão de danos após enfarte do miocárdio. Eritropoetina Anemia

24. Biblioteca de Genes - O processo de multiplicação dos organismos que contêm o rDNA permite não só a produção da substância codificada, mas também a clonagem desse gene. - Os investigadores, conservam, cópias desses genes, conseguidas através da produção de DNA complementar (cDNA), constituindo bibliotecas genómicas ou bibliotecas de genes.

25. Transcriptase reversa – na produção de cDNA (DNA complementar) • Produz uma molécula de DNA a partir de uma molécula de mRNA • Isolada dos retrovírus • Aplicação: Produção de cDNA • A comparação entre o cDNA (que não contém intrões) com o DNA original permite localizar as regiões codificantes (exões) e as não codificantes (intrões) de um determinado gene e facilita a produção de seres eucariontes em bactérias.