FUNDAMENTOS DE LA CITOMETRÍA DE FLUJO

1. FUNDAMENTOS DE LACITOMETRÍA DE FLUJO

2. Relevancia • Estudio directo de las patologías mediante esta tecnología: Conocimiento y búsqueda de información de carácter diagnóstico y pronóstico

3. ¿Qué es la citometría de flujo? Amplificación digitalización Representación y Analisis Meeting point FSC Láser 2- 4º 90º Columna de muestra Detectores de luz Flujo

4. VENTAJAS DE LA CITOMETRÍA DE FLUJO • - Medidas multiparamétricas (x, y, z) en grandes números de células individuales (miles). • - Aumento en la representatividad de las muestras estudiadas y en la precisión de las medidas.

9. Luz incidente FSC Cámara de flujo 90º Luz dispersada hacia delante, a=2- 4º Luz dispersada lateralmente y luz fluorescente, a = 90º Columna de muestra Fluido envolvente

13. Información Que Se Obtiene: Luz • - Propiedades Al Atravesar La Luz: • - Luz Reflejada O Difractada • Propiedades Fluorescentes: • - Fluorocromos (Fitc, Pe, Apc, Tc…)

15. Laser Detector FSC Detector de 90º SSC Luz dispersada a 90 grados (Side SCattered light )

16. SSC FSC DETECCION DE LUZ DISPERSADA HACIA DELANTE (FORWARD SCATTERED LIGHT, FSC) El detector de FSC convierte luz dispersada hacia adelante en un pulso de voltaje proporcional al tamaño de la célula/particula

17. DETECCION DE LUZ DISPERSADA LATERALMENTE (SIDE SCATTERED LIGHT, SSC) SSC FSC El detector de SSC convierte la luz dispersada lateralmente en un pulso de voltaje proporcional a l contenido en orgánulos membranosos (granularidad)

18. Morfología y antígenos de diferenciación en el análisis de la heterogeneidad celular Granulocitos Monocitos Linfocitos

21. Detector Fluorescencia Detector de fluorescencia (PMT3, PMT4 etc.) Detectores de fluorescencia Laser

22. FL-2 Fluorescencia FL-1 FSC

24. Fluorescencia • Proceso por el que una molécula absorbe luz, aumenta su energía y vuelve al estado basal emitiendo un fotón. • Parte de la energía se pierde en las transiciones entre los distintos estados por tanto el fotón emitido tiene menos energía (mayor longitud de onda) que el que fue absorbido.  2  1 E 1<2 t (ms)

25. medida excitación l (nm) Espectros • Espectro de Absorción • Representación de la intensidad de absorción de luz de distintas las longitudes de onda por una sustancia. • Espectro de Emisión • Representación de la intensidad de emisión de una sustancia excitada con luz de una determinada longitud de onda. Intensidad de fluorescencia

27. Fluoresceina (FITC) Emisión Excitación 300 nm 400 nm 500 nm 600 nm 700 nm Wavelength 400 nm 500 nm 600 nm 700 nm Proteinas

28. Proceso de señales • 1. Separación de señales luminosas • 2. Detección de señales luminosas • 3. Amplificación de señales eléctricas • 4. Corrección de errores • Compensación de señales • Discriminación de señales debidas a dobletes (proceso de pulsos). • 6. Transformación de señales eléctricas analógicas en digitales • 7. Almacenamiento matricial (list mode) de la información resultante

29. Optica en los citómetros de flujo PMT 4 Filtros Dicroicos PMT 3 Flujo Celular PMT 2 Bandpass Filtros PMT 1 Laser

30. 350 457 488 514 610 632 300 nm 400 nm 500 nm 600 nm 700 nm Laseres comunes PE-TR Conj. Texas Red PI Etidio PE FITC Acido Parinárico

31. DETECCIÓN DE FLUORESCENCIA TC PerCP QR Fluorocromos Cy5 APC FL-1 FL-2 FL-3 FL-4 Detectores

32. medida l Compensación de señales FL-1 FL-2 excitación • Fundamento Superposición de espectros de emisión. Parte de la señal de emitida por un fluorocromo es leída por el detector de otro color • Concepto sustracción de una parte de la señal medida en un color a la señal medida en otro color • FL-2- %FL1 Intensidad de fluorescencia

33. TIEMPO 1 1 1 1 2 2 2 2 . . . N 1 2 3 4 5 6 7 8 . . . 10000 FSC 2 2 3 4 3 4 2 2 . . . SSC 1 1 2 2 1 2 3 8 . . . FL-1 1 1 3 4 1 1 2 1 . . . FL-2 1 2 3 1 2 3 1 2 . . . FL-3 1 3 3 4 1 1 3 4 . . . FL-4 2 2 3 3 5 5 1 2 . . . DIGITALIZACION Y ALMACENAMIENTO DE INFORMACIÓN Los pulsos de“Voltaje”(señales analógicas) son transformadas en señales digitales Las señales digitales almacenan en un soporte informático en modo listado (almacenamiento multiparamétrico).

34. PROCESO DE INFORMACION Histogramas Diagramas biparamétricos

35. Proceso de la información generada • Representación de la información • Selección de la información • Reducción de la información • De la célula a la población celular

36. Representación monoparamétrica de datos. Histogramas. Se representa en cada valor de x (intensidad de fluorescencia) el número de células que emiten esa intensidad.

39. Histogramas FL-1 SSC FL-2 FSC FL-3

40. Representación biparamétrica en 2D Diagrama de puntos / dot plot - Representación simultánea de dos parámetros X e Y para un conjunto de células. Xrepresenta el valor de la señal de un parámetro. Yrepresenta el valor de la señal del otro. + + + FL-2 - + - - FL-1

43. Diagrama de dot plot density Usa colores para representar densidad

45. - + + + Estadisticas biparamétricas UR UL • Cuadrantes Combinación de dos umbrales de positividad para dos parámetros • Número de células • % de células - - - + LL LR