GAMETI IMMATURI NELLE TECNICHE DI PROCREAZIONE MEDICO ASSISTITA: OOCITI IMMATURI

1. GAMETI IMMATURI NELLE TECNICHE DI PROCREAZIONE MEDICO ASSISTITA: OOCITI IMMATURI

2. Potenziali vantaggi della maturazione in vitro di ovociti immaturi • assenza del trattamento farmacologico • riduzione dei costi • riduzione del rischio di OHSS • trattamento risolutivo nelle pazienti con PCOS • applicazione nei programmi IVF su ciclo naturale • applicazione nei programmi IVF tradizionali • applicazione nei programmi di crioconservazione degli ovociti

3. OHSS (sindrome da iperstimolazione ovarica): è una condizione patologica ad eziologia iatrogena che rappresenta la complicanza più seria dell’induzione della superovulazione. A causa del sempre più elevato numero di donne che si sottopongono ad induzione dell’ovulazione multipla, in corso di trattamenti di fecondazione assistita, questa sindrome è diventata un problema clinico reletivamente frequente. • PCOS: l’applicazione di questa tecnica risulta particolarmente vantaggiosa nelle pazienti con ovaio micropolicistico (PCOS). La PCOS è caratterizzata da anormalità nei parametri endocrini, anovulatorietà, presenza di numerosi piccoli follicoli antrali, assenza del normale pattern di crescita follicolare ed assenza della formazione del follicolo dominante che procede verso l’ovulazione.

4. PROGRAMMI DI IVF SU CICLO NATURALE • Consiste nel prelievo del singolo ovocita che si sviluppa ogni mese fisioogicamente. Tale tecnica può essere applicata o per richiesta della paziente oppure nelle pazienti che per motivi di salute non possono far uso di gonadotropine IVF TRADIZIONALE • L’utilizzo della maturazione in vitro degli ovociti è stata proposta anche nell’ambito di cicli di IVF classica, nei quali si ritrovano generalmente, circa il 10% di ovociti immaturi. L’ applicazione di tale tecnica ci permette di disporre di un maggiore numero di ovociti da inseminare CRIOCONSERVAZIONE • Gli ovociti immaturi possono essere crioconservati con buoni risultati. I dati oggi disponibili dimostrano una buona percentuale di sopravvivenza alla crioconservazione, una percentuale di ovociti con normale fuso mitotico paragonabile a quello di ovociti maturati in vivo o in vitro non sottoposti a crioconservazione.

5. L’ ovogenesi • 24° giorno di sviluppo: cellule germinali primordiali, progenitrici degli ovociti (ovogoni) • dalla sesta settimana: gli ovogoni si moltiplicano per mitosi • 5° mese: si trasformano in ovociti primitivi = termina la mitosi ed inizia la meiosi che si arresta in profase

6. La meiosi • Definizione: fenomeno naturale che permette alle cellule germinali di dimezzare il propio corredo cromosomico e di essere così pronte ad essere fecondate • Meccanismo: due divisioni cellulari consecutive accompagnate da una sola duplicazione dei cromosomi: al termine ogni cellula figlia ha un numero aploide di cromosomi • Attivazione: MIF: fattore prodotto dalle cellule della corticale ovarica • Funzione: possibilità di unione con lo spermatozoo aploide e formazione dello zigote diploide con creazione di nuove combinazioni di geni (crossing over) • Classificazione: MI: interessa gli ovociti primari diploidi e forma 1 ovocita secondario + il primo globulo polareMII: si forma la cellula uovo + il secondo globulo polare

7. Le varie fasi del processo meiotico: Ia divisione meiotica (1) PROFASE I • leptotene: i cromosomi appaiono come filamenti distinti in numero diploide • zigotene: appaiamento dei cromosomi omologhi, indispensabile per il crossing-over • pachitene: crossing-over tra segmenti di cromosomi omologhi. • diplotene: intensa attività trascrizionale, per accumulare RNA-m. L’ ovocita è caratterizzato da un nucleo di forma caratteristica detta VESCICOLA GERMINALE • diacinesi: sparisce l’involucro nucleare e il nucleolo si dissolve: è finita la prima parte della meiosi

8. Le varie fasi del processo meiotico: Ia divisione meiotica (2) METAFASE I • formazione del fuso mitotico e allineamento degli omologhi ANAFASE I • i cromosomi si separano completamente e vanno verso il polo TELOFASE I • riformazione dell’involucro nucleare con distribuzione assimmetrica del materiale citoplasmatico

9. Le varie fasi del processo meiotico: IIa divisione meiotica • viene completata ad ogni ovulazione conferendo all’ovocita la possibilità di essere fecondato PROFASE II • in risposta al picco pre-ovulatorio delle gonadotropine, l’attività nucleare riprrende: l’ ovocita completa la prima divisione meiotica ed elimina il primo globulo polare: l’ovocita ora detto secondario inizia la seconda divisione meiotica ma si arresta in MII METAFASE II • si forma il fuso e scompare l’involucro nucleare. Comincia l’allineamento dei cromosomi: solo dopo l’ovulazione e la successiva fertilizzazione, l’ovocita completerà anche la seconda divisione meiotica con l’estrusione del secondo globulo polare ANAFASE II • i cromosomi si dispongono sul piano nucleare, il centromero di ogni cromosoma si divide e migra al polo TELOFASE II • si riforma l’involucro nucleare e i cromosomi si despiralizzano parzialmente.

10. Il gamete femminile Dimensioni: 150 Caratteristiche morfologiche • grosso nucleo detto vescicola germinale • citoplasma con strato corticale vischioso responsabile del blocco della polispermia • contiene grandi quote di ribosomi liberi necessari alle prime sintesi proteiche del futuro embrione • zona pellucida: esterna al citoplasma, costituita da materiale glicoproteico importante per i primi stadi di sviluppo dell’ embrione • corona radiata: esterna alla zona pellucida • matrice extracellulare

11. Principali caratteristiche morfologiche dell’ovocita molto immaturo (metafase I) • Non è visibile ne il globulo polare, ne la vescicola germinale. • L’ooplasma, rotondo e regolare, è leggermente colorato e a volte presenta fini granulosità. • Le cellule della corona sono lievemente espanse. • Le cellule del cumulo possono presentare vari gradi di espansione ma sono molto compatte ed aderiscono strettamente all’ovocita.

12. Principali caratteristiche morfologiche dell’ovocita immaturo (profase I) • Il nucleo presenta un tipico aspetto vescicoloso ed è per questo chiamato vescicola germinale è più o meno sferico e presenta un nucleolo in posizione eccentrica. la vescicola germinale è disposta tanto più centralmente quanto più immaturo è il nucleo dell’ovocita. • L’ooplasma, omogeneamente granulare, si presenta di aspetto più scuro. • Le cellule del cumulo possono presentare qualche grado di espansione. • Le cellule della corona sono compatte e strettamente addossate alla zona pellucida.

13. Principali caratteristiche morfologiche dell’ovocita maturo (metafase II) • Globulo polare estruso (spesso difficilmente visualizzabile) • Ooplasma rotondo e regolare, leggermente colorato e con granulosità omogenea • Cellule della corona con tipica disposizione radiata • Cellule del cumulo espanse e sospese in una fine matrice mucopolissacaridica circondano regolarmente l’ovocita • Cellule della granulosa, larghe e abbondanti, associate lassamente tra loro.

14. Principali caratteristiche morfologiche dell’ovocita molto maturo. • Il cumulo è molto espanso e circonda regolarmente l’ovocita • Le cellule della corona sono presenti ma non più adese all’ovocita Principali caratteristiche morfologiche dell’ ovocita post-maturo • Il cumulo è degenerato in una massa gelatinosa che circonda l’ovocita

15. Maturazione in vivo degli ovociti umani ovocita primario in PROFASE I, accumula RNAm, proteine e macromolecole necessarie per il completamento della meiosi e per le prime fasi di sviiluppo dell’ embrione in fase preovulatoria, riprende la meiosi e diventa ovocita secondario: si arresta in metafase II sino alla eventuale fertilizzazione • Cosa regola il mantenimento del blocco meiotico? e cosa regola la sua ripresa al momento dell’ovulazione?Numerose molecole sono chiamate in causa e sono quelle che ci permettono di portare a maturazione gli ovociti in vitro.

16. Le molecole in grado di influenzare l’attività nucleare dell’ovocita INIBITORI • AMPc: mantiene l’arresto meiotico • basi puriniche: mantengono l’arresto meiotico • componenti del fluido follicolare: steroidi (estradiolo, testosterone), acidi grassi: mantengono l’arresto meiotico in relazione con la fase di sviluppo del follicolo, decrescono a mano a mano che il follicolo cresce • MPF (proteine citoplasmatiche) : favoriscono la meiosi • Epidermal Grow Factor: favorisce la meiosi PROMOTORI • Insulina Grow Factor: stimola la steroidigenesi • GnRH: induce la maturazione dell’ovocita • Calcio: riduce i livelli di AMPc

17. OVAIO STIMOLATOAGO lunghezza 30 cm 17 gauge angolo piatto più morbido inserimento con angolo rivolto verso l’alto PRESSIONE DI ASPIRAZIONE 15 Kpa GIORNO DEL PRELIEVO dopo circa 11-13 giorni di stimolazione con gonadotropine OVAIO NON STIMOLATO lunghezza 20 cm17 gaugeridotta angolazionepiù rigidoinserimento con angolo rivolto verso il basso 7,5 KPa 10°-12° giorno del ciclo mestruale per pz normo-ovulatorie, indifferentemente per pz non-ovulatorie Il prelievo degli ovociti immaturi

18. Numero di ovociti recuperati in base alle caratteristiche cliniche delle pazienti (Jones 1997) NUMERO DI CARATTERISTICHE OVOCITI RECUPERATI CLINICHE DELLE PAZIENTI 21,6 PCO-NON OVULATORIE 12,3 PCO-OVULATORIE 5,4 NON-PCO

19. Variabili che influiscono sulla buona maturazione ovocitaria in vitro • mezzo di coltura: più è simile all’ambiente follicolare in fase preovulatoria, più è efficace • tempo di coltura: maggiore è il tempo di coltura, maggiori sono le percentuali di maturazione • associazione cumulo e cellule della granulosa: hanno più alta percentuale di maturazione gli ovociti circondati da cellule • dimensione dei follicoli: la quota di ovociti in grado di maturare è maggiore per gli ovociti recuperati da follicoli grandi • grandezza degli ovociti recuperati: la quota di ovociti in grado di maturare è maggiore per gli ovociti di dimensioni superiori a 105m

20. Medium di coltura • sono terreni a semplice composizione di sali a cui vengono addizionate varie sostanze • si ottengono i migliori risultati dai medium che più assomigliano all’ambiente follicolare in fase preovulatoria

21. Percentuale di maturazione ovocitaria in relazione al tempo di coltura ORE DI COLTURA PERCENTUALE DI MATURAZIONE 24 ore 50% 48 ore 87.5%

22. Percentuale di fertilizzazione degli ovociti immaturi:IVF e ICSI a confronto. IVF ICSIBARNES (1996) 34% 67% HWANG (1997) 54% 83%

23. Principali variabili cliniche e loro rapporto con la maturazione in vitro ETA’ • non influisce sulla capacità di maturazione ovocitaria, però si riduce il numero di ovociti recuperati • non influisce sulla percentuale di fertilizzazione PCOS • il numero di ovociti recuperati è maggiore • sono ovociti con poche o senza cellule del cumulo • la quota di maturazione, fertilizzazione, divisione embrionale è più bassa