Otras PCR: PCR en tiempo real (cuantitativa)

1. Otras PCR: PCR en tiempo real (cuantitativa) Curso PCR 2011-12 Inmaculada Martín Burriel minma@unizar.es Curso PCR 2011-2012

2. Programa: • Miércoles 18 de enero (10 h) Aula Grados: • PCR en Tiempo Real (teoría) • Aplicaciones de la PCR en Tiempo Real: • Diagnóstico, expresión génica, análisis mutaciones. • Ejemplo: Perfiles de expresión génica en scrapie • Protocolo experimental (15 h) Aula Grados • Diseño de primers y sonda (Primer express). • Validación de primers. • Optimización de la reacción: • Matriz de primers • Matriz de sonda • Curva standard. • Normalización de datos de expresión Curso PCR 2011-2012

3. Programa: • Jueves 19 de enero (10h) LAGENBIO: • Práctica: Realización de una PCR en tiempo real. • Aplicaciones de la PCR en Tiempo Real : • Diagnóstico, expresión génica, análisis mutaciones. • Ejemplo: Perfiles de expresión génica en scrapie Curso PCR 2011-2012

4. PCR clásico • La cantidad de producto no está relacionada con la cantidad de DNA inicial • Herramienta cualitativa (presencia o ausencia) • El bromuro de etidio es poco sensible, cuando se detecta ya se ha sobrepasado la fase exponencial Curso PCR 2011-2012

5. Técnicas de cuantificación • Northern Blot Curso PCR 2011-2012

6. PCR Competitivo o PCR “Mimic” Early expression of p53 responsive genes (24h) Bax CD95/Fas GAPDH L C 6 8 10 12 M Curso PCR 2011-2012 Martín-Burriel et al. (2004)

7. PCR Competitivo o PCR “Mimic” Overexpression of antiapoptotic and carcinogenic related markers Bcl-2 Tgf-b1 c-myc L C 6 8 10 12 M Curso PCR 2011-2012

8. PCR Competitivo o PCR “Mimic” Curso PCR 2011-2012 Martín-Burriel et al. (2004) Toxicol Pathol

9. Necesidad de PCR en tiempo real • Necesidad de cuantificar diferencias de expresión de un mRNA • Disponibilidad de muy pequeñas cantidades de mRNA en algunas prácticas laboratoriales: • Células obtenidas de microdisección por láser • Pequeñas cantidades de tejido • Biopsias embrionarias • Especimenes de gran valor Curso PCR 2011-2012

10. Nuevos químicos Nuevas plataformas instrumentales Permite observar la cinética de la reacción PCR en Tiempo Real Detección de productos PCR en tiempo real Curso PCR 2011-2012

11. Fases de la PCR • Exponencial: En cada ciclo se dobla el producto. • Lineal: enlentecimiento, consumo de componentes, principio de degradación. • Meseta: Parada de la reacción, agotamiento de componentes, degradación de productos. Curso PCR 2011-2012

12. Fases de la PCR Logarítmica Lineal Curso PCR 2011-2012

13. Detección en la fase exponencial Curso PCR 2011-2012

14. Detección en la fase de meseta Problemas de cuantificación en la fase de meseta Curso PCR 2011-2012

15. PCR en Tiempo Real • Toma los datos mientras se producen. • Cuantificación más exacta sin necesidad de métodos laboriosos. • Existe una relación cuantitativa entre la cantidad inicial y la cantidad de producto PCR en un ciclo dado. Curso PCR 2011-2012

16. Flurocromos: SYBR Green • Se intercala en el surco menor del ADN de doble cadena y emite fluorescencia. • No es equimolecular. • Necesaria curva de disociación. Curso PCR 2011-2012

17. Curva de disociación • Tª Melting: • Composición de bases del fragmento • Tamaño del fragmento. • Tm dimeros < Tm fragmento Curso PCR 2011-2012

18. Curva de disociación Curso PCR 2011-2012

19. Curva de disociación Muestras problema Controles negativos y sin RT Curso PCR 2011-2012

20. Ventajas e inconvenientes • PCR con SYBR Green: • Más barato • Los mismos reactivos sirven para analizar cualquier fragmento • La especificidad viene dada únicamente por los primers • No es equimolecular • Se necesita realizar una curva de disociación Curso PCR 2011-2012

21. Sondas TaqMan • Actividad 5’ exonucleasa de la Taq polimerasa. • Reporter: FAM, VIC. • Quencher: TAMRA. • Importante tªm (~70ºC). • Equimolecular. Curso PCR 2011-2012

22. Especificidad Diseño de sondas entre dos exones Curso PCR 2011-2012

23. Equimolaridad SYBR Green TaqMan Curso PCR 2011-2012

24. Sondas MGB • NFQ: • Quencher oscuro, no emite fluorescencia. • Disminuye Baseline. • Aumenta sensibilidad. • MGB: • Se une al surco pequeño. • Aumenta la Tªm. • Aumenta la eficiencia. MGB R NFQ Curso PCR 2011-2012

25. Ventajas e inconvenientes • PCR con Sondas TaqMan: • Más caro • Utilización de sondas específicas para cada fragmento a analizar • La especificidad viene dada por los primers y la sonda • Es equimolecular • No necesita curva de disociación Curso PCR 2011-2012

26. Aplicaciones de la PCR-TR • Glosario de términos. • Cuantificación: • Absoluta • Relativa • Determinación de mutaciones. • Ensayos +- Curso PCR 2011-2012

27. Aplicaciones de la PCR-TR • Glosario de términos. • Cuantificación: • Absoluta • Relativa • Determinación de mutaciones. • Ensayos +- Curso PCR 2011-2012

28. Glosario de términos • Cuantificación: • Absoluta: • Resultado final con unidades (carga viral, copias de mensajero, copias de un gen,...). • Se necesita una curva patrón absoluta. • Relativa: • Resultado sin unidades. Proporciona un porcentaje de incremento o disminución (expresión génica). • Se necesita curva patrón (al menos para prueba de primers). Curso PCR 2011-2012

29. Glosario de términos • Referencia: • Señal utilizada para normalizar el experimento. • Pasiva: Fluorocromo en todos los tubos (ROX). • Activa: endógena (housekeeping) o exógena (construcción). • Calibrador: • Muestra que usamos para comparar las demás. Curso PCR 2011-2012

30. Glosario de términos • Standard (patrón): • Muestra de concentración conocida que nos permite construir la curva de calibrado. • Threshold (umbral): • Ct es el ciclo en el cual se detecta un incremento significativo de DRn (fluorescencia). El sistema empieza a detectar la señal asociada al incremento exponencial de producto PCR (Fase exponencial) Curso PCR 2011-2012

31. Aplicaciones de la PCR-TR • Glosario de términos. • Cuantificación: • Absoluta • Relativa • Determinación de mutaciones. • Ensayos +- Curso PCR 2011-2012

32. Métodos de cuantificación • Curva estándar • Delta Ct • Método de Pfaffl Curso PCR 2011-2012

33. Curva estándar Curso PCR 2011-2012

34. Curva estándar Curso PCR 2011-2012

35. Curva Patrón • y=ax+b.Y=Ct, X=log [DNA]. • Relaciona cada concentración con su Ct. • Propia de cada pareja de primers. • La pendientedepende de la eficiencia de los primers y no debería cambiar entre experimentos: • 100% (a=-3.32). • 75% (a=-4). • Aceptable:-3 ≤ -4. • a> -3 contaminación por fluorescencia. Curso PCR 2011-2012

36. Curva Patrón • Correlación (R2): • R2=1 (perfecta). • R2≥0.97 (0.99). • Seleccionar el umbral donde R2 sea máxima. • Mantener el umbral entre experimentos. • Nº de réplicas: • Al menos 2 réplicas por muestra. • Desviación estándar ≤ 0.38 • Muestra: • Curva absoluta: muestra de [] conocida. • Diluciones 1/5. Curso PCR 2011-2012

37. 1. Cuantificación Absoluta • Validación de la curva patrón: • La precisión de la cuantificación dependerá de la precisión de los patrones. • Patrones: • DNA plasmídico. • DNA genómico. • Productos PCR. • Grandes oligonucleótidos comerciales. • Resultado final relativo a una unidad de interés: • Copias/ng de RNA • Copias/g tejido, copias/ml sangre. • Copias/genoma. • Copias/ célula. ATENCION DENOMINADOR Curso PCR 2011-2012

38. 1. Cuantificación Absoluta • Posibles curvas de calibrado (Expresión génica): • Productos de RT-PCR u oligonucleótidos: • Rápido, conocimiento preciso de [DNA]. • Inestable, problemas en la reamplificación. • DNA recombinante: • Muy estable, sin problemas de amplificación, talla similar a transcritos. • Construcción del DNArec, no tiene en cuenta la eficacia de la RT. • RNA recombinante: • Mimetiza la situación real de retrotranscripción (añadir RNA background). • Muy inestable, clonación complicado, purificación, problemas de almacenamiento. Curso PCR 2011-2012

39. 1. Cuantificación Absoluta • Puntos críticos de la curva patrón: • DNA o RNA puro y muy concentrado. • Exactitud en la medida de la concentración inicial (7 veces). • Pipeteo apropiado: dilución del DNA o RNA original hasta concentraciones similares a las muestras biológicas (106-1012). • Estabilidad de las muestras patrón (RNA). Curso PCR 2011-2012

40. 2. Cuantificación Relativa • Curva patrón: • Sencillez en la preparación. • La cantidad de producto (n veces) se refiere a la obtenida en el calibrador (1x). • No hay unidades. • Se puede utilizar cualquier tipo de patrón para la obtención. Curso PCR 2011-2012

41. 2. Cuantificación Relativa • Puntos críticos de la curva patrón: • Dilución adecuada del RNA o DNA patrón. • La utilización de las mismas muestras en placas distintas permite comparar resultados. • Se pueden utilizar patrones DNA para análisis de RNA. • Se necesitan curvas patrón para el gen de estudio y el control endógeno. Curso PCR 2011-2012

42. Cuantificación de la expresión génica Referencia activa: • Control de la eficiencia de la Retro-transcripción. • Control de la eficiencia de la extracción de RNA. • Buscar referencias bibliográficas. • Utilizar tres endógenos. Curso PCR 2011-2012

43. 0.49/0.0121 = 24.54 0.627/0.38 Análisis de expresión CON curva patrón Gen Referencia: GAPDH Gen Estudio: SPP1 21.58 27.68 16.62 27.36 -0.2 0.627 -0.3 0.49 -1.92 0.0121 -0.42 0.38 Cantidad relativa Cantidad relativa T0 T7 Qgen trat/Q norm trat =Fold Change Q gen Ctrl/Q norm Ctrl Curso PCR 2011-2012

44. Cuantificación Relativa La eficiencia de la PCR puede enmascarar resultados. Curso PCR 2011-2012

45. Método de Pfaffl (2001) Eficiencia: pendiente de la curva patrón Curso PCR 2011-2012 http://pathmicro.med.sc.edu/pcr/dnaveff.jpg

46. Método de Pfaffl (2001) • eficiencia =10-1/pendiente • Si la eficiencia es del 100% e=10-1/-3.32=2 Curso PCR 2011-2012

47. Análisis de expresión SIN curva patrón • Método de comparación de Ct= 2-DDCt DDCt= DCt , muestra-DCt, calibrador DCt , muestra: Valor de Ct para una muestra normalizado con el del control endógeno. DCt , calibrador: Valor de Ct para el calibrador normalizado con el del control endógeno. Expresión gen/ Expresión basal del gen =2-DDCt Expresión endógeno/ Expresión basal endóg Curso PCR 2011-2012

48. Análisis de expresión SIN curva patrón • Método de comparación de Ct • Se basa en la eficiencia de los primers • Se refiere a la muestra con mayor cantidad de gen de estudio (o menor Ct) • Q = e(menor Ct- Ct muestra) • e =10-1/pendiente • Si la eficiencia es del 100% e=10-1/-3.32=2 Ejemplo Curso PCR 2011-2012

49. 2. Cuantificación Relativa • PCR Múltiple: • Amplificación del gen de interés y el endógeno en el mismo tubo. • Reporter: 6-FAM y JOE. • Evitar competición en la reacción: • Limitar la concentración de primers del gen más abundante. Curso PCR 2011-2012

50. Cuantificación Relativa • Elección del método: • Estudio del gen de interés y del endógeno en tubos distintos y usar curva patrón: • Rápida optimización y validación. • Utilización del método 2-DDCt : • Se necesitan eficiencias de amplificación similares. • No necesita curva patrón. • Elimina los errores de dilución de la curva patrón. • Preferible el método de Pfeffl una vez calculada la eficiencia • PCR Múltiple: • Más puesta a punto. • Mayor rapidez de análisis. Curso PCR 2011-2012