Typy vyšetření a metod používaných v naší molekulárně genetické laboratoři

1. Typy vyšetření a metod používaných v naší molekulárně genetické laboratoři RNDr. Hana Kolaříková 2011

2. Molekulárně genetická laboratoř MUDr. Jana Zvolská klinický genetik RNDr. Hana Kolaříková RNDr. Jiří Fišer Mgr. Lenka Hrdá odborní pracovníci laboratoře ČSN EN ISO 9001: 2009 SÚKL ČSN EN ISO 15 189 (2011?) Opavská 39 Ostrava – Poruba Tel.: 596 973 356

3. Žádanka • Průvodní doklad ke každému vzorku • Výčet všech vyšetření mutací nebo specifických alel v humáním genomu (jaderná DNA) • Informovaný souhlas

4. Výčet vyšetření • Predispozice k žilní trombóze - PCR , reverzní hybridizace • Morbus Wilson - PCR, přímé sekvenování • Cystická fibróza - PCR, reverzní hybridizace • Celiakie - PCR, elektroforéza na agarózovém gelu • Laktózová intolerance - PCR , reverzní hybridizace • Bechtěrevova nemoc - PCR, elektroforéza na agarózovém gelu • Prelinguální hluchota - PCR, přímé sekvenování • Gilbertův syndrom - PCR, fragmentační analýza • Mikrodelece na Y chromozomu - PCR, fragmentační analýza • Identifikace(paternity, forenzní vzorky) - PCR, fragmentační analýza

5. Výčet metod 1) Chemické metody • Izolace (lýza, purifikace, srážení) • Separace (elektroforéza) • Hybridizace / denaturace • Fragmentační analýza / sekvenování • Real Time PCR 2) Enzymatické metody • PCR syntéza úseků DNA (DNA polymerázy) • Štěpení (restrikční endonukleázy)

6. Výčet metod • PCR (ASO, SEKVENAČNÍ) • ELEKTROFORÉZA V GELU • REVERZNÍ HYBRIDIZACE • FRAGMENTAČNÍ ANALÝZA • PŘÍMÉ SEKVENOVÁNÍ • REAL TIME

7. Průchod vzorku laboratoří ……z čeho vycházíme při analýze?

8. Typy vzorků • Nejčastěji: • Periferní krev • Plodová voda • Méně často: • Tkáně / i v parafinových bločcích • Vlasy

9. Vzorek venózní krve- odběr minimálně 2,5 ml plné do K3EDTA - uchování v lednici (stabilita v řádu týdnů)- transport do laboratoře - nezaměnitelné označení – dva identifikační údaje

10. FTA karta - alternativní varianta - snadné skladování a transport - pro některé typy vyšetření nevhodná

11. 1. Izolace DNA

12. Detail laboratorního boxu • Laminární box třídy II • ochrana vzorku • ochrana personálu

13. Mikrokolona k izolaci DNA z plné krve, tkání apod.

14. Automatickýizolátor DNA Izolace DNA Promývací a lyzační pufry Mikrokolony k zachycení DNA Přístroje nutné k provedení izolace

15. Izolát DNA- DNA - ve vodě nebo pufru- za vhodných podmínek dlouhodobě skladovatelný a použitelný- neznámá koncentrace

16. 2. Kvantifikace DNA

17. Kvantifikace DNA – proč? • Fakultativní krok • Analýzy dle typu vyžadují od cca 0,5 ng až několik desítek ng DNA • Údaj o koncentraci eliminuje nutnost opakovat vyšetření • Údaj o koncentraci zvyšuje kvalitu následně získaných výsledků

18. Kvantifikace DNA – jak? • ELFO na agarozovém gelu • UV – spektrofometrie • Fluorescenční značky a fluorometr • RT-PCR se značenou specifickou sondou

19. Fluorometr Qubit Invitrogen, USA -malý -rychlý -spolehlivý -dostatečně přesný Elektroforetické vany a zdroje

20. 3. PCR • Příprava MasterMixu • Amplifikace

21. PCR – základ všech vyšetření PCR - polymerázová řetězová reakce In vitro enzymatické namnožení žádaného úseku DNA MasterMix - Primery –oligonukleotidy, uměle syntetizované nukleotidové řetězce max. 30 bazí, vymezuje kýženou oblast (mohou být značené fluorescenčními barvami) - Enzym – polymeráza, „připojuje“ na 3´ konec primeru k matrici komplementární báze - Nukleotidy dNTPs (deoxynukleosidtrifosfáty) - Pufry pro zajištění optimálního prostředí Matrice – DNA

22. Příprava MasterMixu • na kontaminaci nejnáchylnější • krok • čisté prostředí • nejlépe oddělený prostor „ work • place“ • samostatná sada pipet a • dalších potřebných pomůcek

25. PCR cykler • amplifikace DNA in vitro • programovatelný • dva na sobě nezávislé bloky • objem 0,2 ml • vyhřívané víko

26. Ověření amplifikace ELFO sestava - zdroj stejnosměrného napětí - horizontální elfo vana - primery - produkty PCR, amplikony - velikostní ladder

27. 4. Analýza produktů PCR Celá řada možností jak amplikony analyzovat. Délková variabilita elektroforéza v agarózovém / v polyakryl amidovém gelu fragmentační analýza ektroforéza v tenké kapiláře Sekvenční variabilita hybridizace se specifickou sondou na membráně přímé sekvenování

28. Elektroforéza v geluCeliakie, HLA B27, DNA profily Separační i analytická metoda Dělení produktů PCR: Agarózový / polyakrylamidový gel Stejnosměrné elektrické pole Pohyblivost DNA fragmentů: • Délce amplikonu • Konformaci • Koncentraci agarózy • Napětí Vizualizace: • Ethidium bromid, SYBRGreen / Iluminátor UV • AgNO3

29. Elektroforéza ve agarózovém gelu ladder Prostředí 1 x TBE Konstantní napětí 150 V Čas 30 min. vzorek PK blank dH2O K 3 2 /3 1 1/ 4 K =kontrola amplifikace 1 = HLA-DQA1*05 2 = HLA-DQB1*02 3 = HLA-DQB1*0302 4 = HLA-DQA1*03

30. Prostředí 0,5 x TBE Konstantní napětí 1 800 V Čas 3 hod. 1 – ladder 2 - vzorky Elektroforéza v polyakrylamidovém gelu 1 2

31. Elektroforéza v tenké kapilářeFragmentační analýzaGilbertův sy, mikrodelece na chromozomu Y, DNA profil • PCR s primery značenými různými fluorescenčními barvami • Před analýzou je potřeba PCR fragmenty denaturovat a přidat k nim interní standard • PCR fragmenty jsou děleny na podobném principu jako u předešlých typů elektroforéz • Kapilára může mít různou délku a je naplněna speciálním polymerem • PCR fragmenty jsou při výstupu z kapiláry detekovány systémem laser –CCD kamera

32. Sekvenátor3 100 AVANT, ABI

34. Výsledky fragmentační analýzy

36. Gilbertův syndrom

37. Stanovení mikrodelecí na chromozomu Y

38. Reverzní hybridizace • Alelově specifické oligonukleotidy - sondy navázané na nosiči ve tvaru proužku – strip • Vždy dvě sondy, jedna pro wt a druhá pro mut • V prvním kroku je PCR produkt denaturován – chemicky • Následuje hybridizace, tedy konfrontace sony s PCR produkty • Stringentníodmytí nespecificky navázaných PCR produktů • Barvení typu biotin avidin

39. Hybridizační stripy

40. Pomůcky pro hybridizaci

41. Mutace v genech pro trombofilní faktory

42. 1. PCR klasická s oběma primeryForward i Reverse 2. sekvenační PCR vždy jen s jedním primerem a se značenými ddnukleosidtrifosfáty G C G G A T A C G C C T A T T A G G C G C G ……. G C G G A T A A C G C C T A T T A G G C G C G ……. G C G G A T A AT C G C C T A T T A G G C G C G ……. G C G G A T A A T C C G C C T A T T A G G C G C G ……. ddATP ddTPP ddCTP ddGTP Sekvenování

43. Princip sekvenování G C G G A T A C G C C T A T T A G G C G C G ……. ddATPddGTP / dGTPddATP / dATP G C G G A T A AddTPP / dTPP C G C C T A T T A G G C G C G …….ddATPddCTP / dCTP G C G G A T A AT C G C C T A T T A G G C G C G …….ddTPP G C G G A T A A T C C G C C T A T T A G G C G C G …….ddCTP

44. Elektroforetogramsekvenace

45. Real Time PCR 1) Absolutní kvantifikace množství DNA ve vzorku především detekce virální či bakteriální DNA, forenzní chemie 2) Koncová detekce SNP genotypizace, detekcemutací a polymorfismů 3) Relativní kvantifikace srovnání úrovně exprese mRNA nebo mikroRNA mezi různými tkáněmi či biologickými podmínkami

46. 7 300 RealTime PCR SystemABI

47. RT PCR Měření vznikající fluorescence po každém cyklu PCR, stanovení křivek tání • Interkalační barviva (levnější) • (např. SYBR green I, Ethidium bromid) • Fluorescenčně značené sondy (přesnější) • Hybridizační próby (hybridisingprobes) • Hydrolyzační próby (hydrolysisprobes)

48. Vazba SYBR Green na dsDNA Sondy značené fluoresceinem (3´)-donor a LC Red(5´) FRET systém (fluorescence resonance energy transfer akceptor) Specifická sonda - TaqMan fluorescence vzniká po hydrolýze sondy

49. Využití RT PCR v naší laboratoři • Především mutace v genech pro koagulační faktory Faktor V (Leidenská mutace, R2) Faktor II (protrombinová mutace) MTHFR, F XIII, PAI, EPCR • Mutace v genu pro laktázu - 13910 T to C, -22018 A to G

50. …..děkuji za pozornost