ATP ( adenozin-trifoszfát ) meghatározás a TCA ( triklóracetát ) extrakciós módszerrel

1. ATP (adenozin-trifoszfát) meghatározás a TCA (triklóracetát) extrakciós módszerrel

2. az ATP (adenozin-trifoszfát) minden élő szervezetben megtalálható allosztérikus effektorként, csoport-hordozó koenzimként és szubsztrátként működik allosztérikus: az enzim nem csupán a szubsztrátkötésre alkalmas katalitikus hellyel rendelkezik, hanem még egy vagy több más, olyanhellyel is, ahol kicsiny, a szubsztráttól eltérő szerkezetű, szabályozó molekula, effektor vagy ligand megkötése válik lehetségessé (allosztéria = más alakú)  az ATP a legfontosabb molekula a sejtekben lejátszódó energia leadó és felvevő folyamatokban, az elhalt sejtekben az ATP gyorsan degradálódik → a mikrobiális aktivitás becslésére használható paraméter a talajból kivonható, majd mennyisége meghatározható adenozin-trifoszfát

3. legelterjedtebb: az ATP biolumineszcens reakciója segítségével (luciferin-luciferáz rendszer) • gyors módszer • nagyon érzékeny kimutatás • HPLC módszerrel • nem elterjedt • sok időt vesz igénybe az analízis • drága a szükséges felszerelés A meghatározásra alkalmazott módszerek

4. A lumineszcencia olyan kémiai folyamat, ahol a molekula energia hatására gerjesztett állapotba kerül, majd alapállapotába visszajutva, fényt bocsát ki. • az ATP a biokémiai reakció során luciferin-luciferáz enzimpreparátum hatására lebomlik, miközben biolumineszcencia (fénykibocsátás) történik • az enzim reakcióba lép az élő szervezetek – mikrobák – energiataroló komponensével, az ATP-vel • a reakció során oxiluciferin-luciferáz-AMP komplex képződik, amely oxidálódik • a gerjesztett állapotban levő átmeneti komplex (*-gal jelölve) energiatöbbletét a normál állapotba visszatérve foton formájában adja le Az ATP biolumineszcens reakciója

5. A kibocsátott fény - műszeresen – luminométer segítségével detektálható • minél erősebb a fényintenzitás, annál magasabb az ATP-tartalom, a mérés rendkívül érzékeny, hiszen 10-13 g ATP már kimutatható A reakcióegyenletek

6. Előnyök: • rendkívül kis mennyiségű ATP jelenléte már nagy biztonsággal kimutatható • rendkívül gyors vizsgálati módszer (a reakció 10 másodpercen belül lejátszódik) • Hátrányok: • az ATP extrakciós hatásfoka erősen függ • a használt extraháló szertől • az ATPáz és ATP kináz enzimek inaktivitásának sebességétől és intenzitásától • az ATP adszorpciójától a talaj szerves és ásványi kolloidokon • a talaj kivonatokban található különböző vegyületeknek (pl. NO3- Mg2+, Ca2+, Cl-) gátló hatása lehet a luciferáz aktivitására • néhány vegyület (pl . Fe3+) komplexet alakít ki az ATP-vel • a talajban az ATP-t ki lehet vonni növények gyökereiből és állati sejtekből is a mikrobiális sejtek mellett (az az ATP interferál a mikrobiális aktivitással) Sok fajta ATP extrakciós módszert használnak: • az egyik ilyen: a TCA (triklóracetát) extrakciós módszer Előnyök - hátrányok

7. A TCA (triklóracetát) extrakciós módszer A módszer elve: az ATP extrakciója a talajból triklóracetát- foszfát- paraquat keverék segítségével, majd a kivont ATP mennyiségi meghatározása a luciferin-luciferáz rendszerrel Szükséges anyagok és készülékek • luminométer és küvetták • ultrahangos és egy 12.5 átmérőjű szonda • minicentrifuga (Eppendorf centrifuga és csövek) • jégfürdő • szűrő (Whatman 44) • pH mérő • finnpipetta és steril csíkok • üvegcsövek • polipropilén vagy üveg centrifuga csövek Szükséges anyagok és oldószerek • EDTA-magnézium arzenát puffer • TCA-foszfát-paraquat extraháló oldat • Luciferin-luciferáz keverék • belső standard ATP-oldat (10-3 M)

8. EDTA-magnézium-arzenátpufferoldat • 1.oldat: 31,2 g Na2HAsO4·7H2O-et kell feloldani 800 ml vízben, majd hozzáadni 10 ml 0,2 M EDTA oldatot • 2. oldat: 2,46 g MgSO4·7H2O-t kell feloldani 100 ml desztillált vízben • a két oldatot össze kell önteni és 7,4-es pH-ra beállítani 1 M kénsav segítségével , majd 1000 ml-re kiegészíteni desztillált vízzel, hogy az oldat 0,1 M legyen az arzenátra nézve, 10 mM a Mg2+-ra és 2 mM az EDTA-ra • TCA-foszfát-paraquat extraháló oldat • 81,6 g TCA-t és 89,6 g Na2HPO4·12H2O-t kell feloldani 600 ml desztillált vízben • 25,8 g paraquat-dikloridot (1,1-dimetil-4,4-bipiridilium-diklorid) kell feloldani 100 ml desztillált vízben és ezt a TCA-Na2HPO4 oldathoz adni • az így elkészült oldatot vízzel ki kell egészíteni 1000 ml-re, hogy az oldat 0,5 M legyen a TCA-ra nézve, 0,25 M a foszfátra és 0,1 M a paraquatra • Az oldat pH-ja 1,6 lesz és -15 ºC-on kell tárolni Az oldatok elkészítése

9. Luciferin-luciferáz keverék • a tisztított luciferáz és a D-luciferin liofilizált keverékét fel kell oldani 2 ml desztillált vízben injekciós üvegenként a gyártó utasításai szerint (Packard Instrument Co.) • ATP belső standard oldat (10-3 M) • 5,07 g savmentes ATP-t kell feloldani 7 ml steril extraháló szerben, majd kiegészíteni az extraháló szerrel 10 ml-re • minden 0,5 ml ATP oldatot helyezzük egy-egy steril Eppendorf csőbe és tároljuk -20 ºC-on Az oldatok elkészítése

10.  ATP extrakció • 4 adag nedves talaj mintát (<2 mm szemcseméret), amelyek mind 2,5 g szárított talajt tartalmaznak, be kell mérni 50 ml-es polipropilén (vagy üveg) centrifugacsőbe és jégen kell hagyni • 25 ml hideg TCA-foszfát-paraquatextrahálószert kell adni mindegyik kémcsőbe • Két kémcsőbe belső standard ATP oldatot kell tenni • ezek után a talajt 1 percig kell szonikálni a 12,5 mm átmérőjű szondában a BransonSonifier B12 készülékkel, a szonda csúcsa 1 cm-re legyen a folyadék felülete alatt • az ultrahangos kezelés után a kémcsöveket hűteni kell jégen legalább 5 percig, majd szűrni • a szűrt kivonatokat lehet tovább használni Az eljárás

11. Az ATP meghatározása • a talajszűrletethez (50μl) hozzá kell önteni 5 ml EDTA-MG arzenát pufferoldatot és jégen tartani a törzsoldatot • a luciferin-luciferáz keverékből 50μl-t a küvettába kell pipettázni, majd a luminométeren lemérni ezt a vakmintát (az intenzitása nem lehet nagyobb 150 RLU/10 s-nál, RLU (relativelight unit)) • ezután 250 μl-t kell adni a jegelt törzsoldatból a küvettába, majd háromszor mérni egy percen belül a készülékkel a minta intenzitását • A kalibrációs görbe •  A belső standard ATP oldatból küvettákban hígítással kell készíteni egy sorozatot, amelyek ATP koncentrációja rendre legyen 10-5, 10-6, 10-7 és 10-8 M • majd mérni ezen kalibrációs minták intenzitását Az eljárás

12. ATP (μg)/ dwt (g) = (A*ATPS*40) / (B-A) • A: a talajszűrlet minta intenzitása • ATPS: hozzáadott belső standard mennyisége [μg] • B: a belső standard oldatból készült minta intenzitása • dwt: a száraz tömege 1 g nedves talajnak • A paraquat használata nem szükségszerű, mivel hozzáadása csak segíti az extrakciós hatásfok javítását. Nagy hátránya a használatának, hogy erősen mérgező anyag és drága is. • Nem lehet alkalmazni ezt a módszert, ha a talaj több, mint 10% CaCO3 tartalmaz (semlegesíti a TCA-oldatot) • Vizsgálat előtt el kell távolítani a mintából a látható növényi gyökereket és az állati szöveteket, mert a módszer az ezekben található ATP-t is megméri. Számolás és hasznos tanácsok

13. Élelmiszervizsgálati közlemények (1997. XLIII. kötet 2. füzet) • http://www.eoq.hu/evik/evik97-2.pdf • Redox-potenciál mérésén alapuló gyors mikrobiológiai módszer validálása és ipari alakalmazhatóságának vizsgálata - Nádaskiné dr. Szakmár Katalin • http://phd.lib.uni-corvinus.hu/403/1/szakmar_katalin.pdf • Mikrobiális fiziológia – Novák Béla • http://www.cellcycle.bme.hu/oktatas/mikrofiz/extra/metabolizmus_regulacio.pdf • Alef K. and Nannipieri P. (Editors): MethodsinAppliedSoilMicrobiology and Biochemistry, Academic Press Limited, London, 1995 • Estimation of adenosinetriphosphateinsoils • The trichloroaceticacidextractionmethod Felhasznált irodalom