Epigenetika - metylace DNA

1. Epigenetika- metylace DNA

2. Metylace DNA u Eukaryot • nemetylovaná DNA: kvasinka Saccharomyces cerevisiae, • octomilka Drosophila (málo), kroužkovci, hlístice Caenorhabditis • savci:3-8% cytosinových zbytků, CG sekvence • (u embryonálních kmenových buněk i v non-CG kontextu) • - nízký výskyt CG v repetitivních heterochromatinových • oblastech (mutageneze) • rostliny: 25-30% cytosinových zbytků (~ velikosti genomu) • především v repetitivních heterochromatinových oblastech • (pravidelný výskyt nemetylovaných míst – SAR, MAR) • - u větších genomů (obiloviny) ostrovy transkripčně aktivní • DNA s nižším obsahem metC • metC (CG) je ale i v kódujících sekvencích exprimovaných genů!!!

3. O H N T CH3 CH3 N + H2O - NH3 O thymine „horký bod mutageneze“ Mechanismus metylace DNA - metylace bází - cytosinu a adeninu (bakterie – restrikce cizorodé DNA) u Eukaryot je biologicky významná metylace cytosinu na C5 purinového kruhu (u savců i hydroxymethylC) H H H H N N N N C C* + SAM N O N O cytosine 5-methyl cytosine

4. Metylace DNA – cílové sekvence - symetrické (palindromatické) sekvencei nesymetrické sekvence: 5’ -------CG-------CHG----------C---C------G--C---- 3’ 3’ -------GC-------GDC----------G---G------C--G---- 5’ ? (H = A, T nebo C; D = A,T,G) Symetrické sekvence – snadné udržování při replikaci hemimetylovaný stav je signálem pro udržovací metylaci ----C*G------------- C*HG---------- C*------- ---------C*G ---- ---- G C------------ G DC-----------G ------- ---------G C*---- -----CG -------------CHG -----------C-------- -----GC*-------------GDC*-----------G-------- Asymetrické sekvence – nutno neustále metylovat de novo (principielně je ale také udržovací) - signál: metylace histonů a sRNAs

5. Cílová místa metylace DNA v chromatinové struktuře • Preferenční metylace exonů • – souvislost s preferenčním výskytem nukleosómů na exonech (spoludefinování přechodu intron – exon a exon – intron) • (současně zvýšený výskyt polymerázy II - zbrždění nukleozómem) • - bránění inkorporaci H2A.Z • Preferenční výskyt metC na vnější straně nukleozómů • souvisí s preferenčním výskytem C-G na vnější straně (stérické důvody) • lépe přístupný pro metyltransferázy

6. Předpokládaná korelace přítomnosti H2A.Z, metylace DNA a míry/regulovatelnosti exprese ( ) Coleman-Derr and Zilberman 2012 - metylace DNA brání inkorporaci H2A.Z - H2A.Z neumožňuje stabilní expresi (house-keeping genů)

7. Analýzy metylace DNA • Přímé (strukturní): • spektrofotometrie, HPLC (celkový stav) • - %metC • anti metC protilátky (na chromozómu …) • - lokalizace metC bohatých úseků chromozómů • pomocí restriktáz citlivých k metylaci • - detekce metC v konkrétním restrikčním místě • hydrogensiřičitanovým sekvenováním • - přesné určení C a metC v určité sekvenci • - i v celém genomu(v kombinaci s moderními technikami sekvenování) • Nepřímé (funkční) – vztah mezi metylací a genovou expresí • - např. sledování reaktivace umlčených genů

8. Analýzy metylace DNA pomocí restrikčních endonukleáz citlivých k metylaci - štěpení, Southernova hybridizace - PCR, elektroforéza (méně spolehlivé) (izolace krátkých na geny bohatých fragmentů u velkých genomů - kukuřice) A -----------C CGG-----------------------------------CmetCGG--------------------------C CGG---------------------- B -----------C CGG-----------------------------------C CGG--------------------------C CGG---------------------- - štěpení restriktázou citlivou k metylaci cílové sekvence PCR primer elektroforéza a Southern PCR a elektroforéza A B A B

9. Analýzy metylace DNA • hydrogensiřitanová modifikace, • shotgunsequencing • nebo PCR + sekvenace • 1.denaturace • ---------C*---------C--------CC---C*------C------------C-- • 2.modifikace Cyt na Ura • (5metC zůstává nezměněn) • ---------C*---------U--------UU---C*------U------------U-- • 3.PCR, sekvenace • původní sekvence • ---------C---------C-------- CC---C------C------------C-- • ---------G---------G--------GG---G------G------------G-- • modifikovaná sekvence • ---------C---------U--------UU---C------U------------U-- • ---------G---------A--------AA---G------A------------A--

10. Analýza metylace u Arabidopsis „Chromosome epigenetic landscape“ ? ?

11. metC T C G G G Mutace zprostředkované metylací C C T replikace reparace T A • Evoluce genů: • zdvojení sekvencí (např. po polyploidizaci) navodí metylaci • metylace navodí reversibilní inaktivaci • mutace metC může navodit irreversibilní inaktivaci • kopie genu může být postupně masivně mutována • (bez selekčního tlaku) • - vznik a reaktivace genu s novou funkcí

12. Value Feature Chr.1 Chr.2 Chr.3 Chr.4 Chr.5 SUM DNA molecule Length (bp) Top arm (bp) Bottom arm (bp) Base composition (%GC) Overall Coding Non-coding Number of genes Gene density (kb per gene ) Average gene Length (bp) Average peptide Length (bp) Exons Number Total length (bp) Average per gene Average size (bp) Number of genes With ESTs (%) Number of ESTs 29,105,111 14,449,213 14,655,898 19,646,945 3,607,091 16,039,854 23,172,617 13,590,268 9,582,349 17,549,867 3,052,108 14,497,759 25,53,409 11,132,192 14,803,217 115,409,949 33.4 44.0 32.4 35.5 44.0 32.9 35.4 44.3 33.0 35.5 44.1 32.8 34.5 44.1 32.5 6,543 4.0 2,078 446 4,036 4.9 1,949 421 5,220 4.5 1,925 424 3,825 4.6 2,138 448 5,874 4.4 1,974 429 25,498 35,482 8,772,559 5.4 247 19,631 5,100,288 4.9 259 26,570 6,654,507 5.1 250 20,073 5,150,883 5.2 256 31,226 7,571,013 5.3 242 132,982 33,249,250 105,773 60.8 30,522 56.9 14,989 59.8 20,732 61.4 16,605 61.4 22,885 Genom Arabidopsis - statistika

13. Rostlinné cytosin 5-metyltransferázy - 3 rodiny u Arabidopsis MET1(metyltransferase) CMT3a CMT2 (chromomethyltransferase) DRM2 (a DRM1) (domain rearranged methyltransferase)

14. ----C*G------------- C*HG---------- C*------- ---------C*G ---- ---- G C------------ G DC-----------G ------- ---------G C*---- -----CG -------------CHG -----------C-------- -----GC*-------------GDC*-----------G-------- • MET1 (metyltransferase1) • - příbuzná savčí Dnmt1 • - udržovací metylace symetrických CG • - asociovaná s replikací • spoluúčast komplexu remodulujícího nukleosómy DDM1 • (u heterochromatinových sekvencí) • Signál – hemimetylovaná CG sekvence

15. ----C*G------------- C*HG---------- C*------- ---------C*G ---- ---- G C------------ G DC-----------G ------- ---------G C*---- -----CG ------------- CHG -----------C-------- -----GC*-------------GDC*-----------G-------- • CMT3 (chromomethyltransferase3) • - unikátní pro rostliny a houby (příbuzné savčím Dnmt1, ale navíc obsahují chromodoménu = doménu interagující s metLys • - asociovaná především s konstitutivním heterochromatinem (repetitivní sekvence, TE - retrotranspozóny) • „udržovací“ metylace sekvencí CHG • zřejmě kooperace s DDM1 (nukleozómy remodelující protein) • Aktivita podmíněna dimetylací histonu H3 na lyzinu K9 - (interakce zprostředkovaná chromodoménou)

16. ----C*G------------- C*HG---------- C*------- ---------C*G ---- ---- G C------------ GDC-----------G ------- ---------G C*---- -----CG ------------- CHG -----------C-------- -----GC*-------------GDC*-----------G-------- • CMT2 (chromomethyltransferase2) • - příbuzná CMT3, rovněž obsahuje chromodoménu • - asociovaná s konstitutivním heterochromatinem • „udržovací“ metylace sekvencí CHH • kooperace s DDM1 (nukleozómy remodelující protein) • Aktivita podmíněna dimetylací histonu H3 na lyzinu K9 – (interakce zprostředkovaná chromodoménou)

17. ----C*G------------- C*HG---------- C*------- ---------C*G ---- ---- G C------------ G HC-----------G ------- ---------G C*---- -----CG -------------CHG -----------C-------- -----GC*-------------GHC*-----------G-------- • DRM2 a 1(domain rearranged methyltransferase) • příbuzné savčím Dnmt3, ale mají přeskupené domény • DRM1 – v časné fázi vývoje semen • „udržovací metylace“ asymetrických sekvencí CHH (CHG) • regulace genové exprese, silencing • nutná spoluúčast katalyticky neaktivního paralogu DRM3 u • Arabidopsis • Cílové sekvence jsou určeny přítomností homologních siRNA • = RNA-directed DNA Methylation (RdDM)

18. Udržovací metylace DNA Heterochromatin s histonem H1 - střední části dlouhých TE (kódující sekvence) - nutná účast chromatin remodel. faktoru DDM1 - metylace řízena H3K9me2 (CHH, CHG) – CMT2, CMT3 metylací (CG) – MET1 Chromatin bez histonu H1 - okraje TE, krátké TE, geny - účast chromatin remodel. faktoru DRD1 - metylace řízena především siRNA (RdDM) – DRM2 (RdDM – řízena H3K9me2 a nemetyl. H3K4) - metylace CG řízena metylací – MET1

19. Udržovací metylace transpozónů Zemach et al. 2013

20. Demetylace DNA 1) při replikaci s vyloučením aktivity udržovacích cytosin metyltransferáz (a histonových metyláz) 2) DNA glykosylázy (odštěpení metylcytosinu, reparací doplněn cytosin) ROS1 REPRESSOR OF SILENCING – somatické buňky (k demetylaci nutný ROS3 – protein vázající RNA – sRNA ? mRNA) DEMETER-LIKE (DML2, DML3) – somatické buňky DME1 DEMETER – parentální imprinting (endosperm)

21. ros1 dml2 dml3 Demetylace DNA nárůst metylace • ROS1 REPRESSOR OF SILENCING • DEMETER-LIKE (DML2, DML3) • aktivní ochrana genů (promotorů) před • metylací (příp. modulace transkripce) • - mutace v „demetylačních“ genech se projeví především nárustem metylace v 3’ a 5’ UTR • V metylačních (metyltransferázových) mutantech je demetylace utlumena (zpětná vazba). metylace WT

22. Ovlivňování metylace DNA - aplikace 5-azacytidinu – blokování aktivity MET1 - dihydroxypropyladenin (DHPA) – ovlivnění hladiny SAM - (inaktivace genů MET1, DDM1, CMT3, …) Projevy: - různé: žádné až výrazné změny fenotypu (způsobené TE) - pohlavní reverze u knotovky (andromonoecie), fenotyp cycloidea u lnice, …

23. Reaktivace umlčených transgenů 5-azacytidinem hemiMet? deMet - inhibitor MET1 (5-azacytidin, AzaC) + AzaC + AzaC Demethylated - obnovení často jen přechodné! Nocarová, Fischer, nepubl.

24. Stérické důsledky metylace DNA- interpretace metylace DNA • změny na úrovni histonů • - posttranslační modifikace histonů • - SRA domény: metylace (SUVH family), • - Metyl CpG-binding d.: deacetyl. (HDAC) • - zastoupení různých forem histonů (H2A.Z) • změna vazby jiných interagujících proteinů • - regulátorů (aktivátorů a represorů) transkripce • - proteinů zodpovědných za strukturu/modifikace • chromatinu

25. příklad: MBD proteiny (metyl-CpG-binding domain) - rostlinné MBD proteiny nemají TRD (transcription repression domain) - specifita vazby je dána i dalšími interagujícími proteiny - AtMBD5 interaguje i s C*HH - MBD proteiny zřejmě interagují s histon modifikujícími proteiny (HDAC = histon deacetylázy) Model komprimace chromatinu vazbou dimerizujícího AtMBD7 proteinu

26. Autokatalytická smyčka - metylace CHG (CMT3) a metylace H3K9 (KYP, KRYPTONITE) - transkripce indukuje demetylaci H3K9me2 (IBM1) ROS1/ ROS3 ??? x DRM2 Obdobné snížení množství H3K9me2 u mutantů kyp a cmt3 „co je defaultní“ stav?

27. Metylace DNA a stav chromatinu - přehled • - prokázána korelace hypermetylace a hypoacetylace histonů (pozdní replikace DNA) • - metylace DNA je dědičným signálem k deacetylaci histonů a kondenzaci chromatinu • obdobné fenotypové změny při potlačení metylace (MET1) a deacetylace histonů (AtHD1) • přítomnost formy histonu H2A.Z (typické pro promotorové sekvence aktivních genů) se vzájemně vylučuje s DNA metylací !!!

28. Metylace DNA a stav chromatinu • - di(tri-)metylace H3K9 (KYP) je signálem pro metylaci CHG • - metylace CHG je signálem pro metylaci H3K9 • k demetylaci H3K9 (IBM1) zřejmě dochází v souvislosti s transkripcí • demetylace DNA prostřednictvím ROS1 vyžaduje RNA vazebný ROS3 (???) • trimetylace H3K4 je typická pro euchromatin a vzniká v souvislosti s transkripcí (aktivní DNA)

29. Udržování epigenetického stavu • – přehled • Neaktivní chromatin • - MET 1 – udržovací metylace C*G • KYP (SUVH5,6) – H3K9me2  CMT3 - C*HG (CMT2 – C*HH) • DRM2, (DRM1) – udrž. metylace CHH  komplement. siRNA • Aktivní chromatin • IBM1 – demetylace H3K9  transkripce • ROS1/ROS3, DML2, DML3 – demetC  transkripce?, sRNA?

30. Vzájemná provázanost metylace DNA a struktury chromatinu metC = modifikace dvoušroubovice DNA post- translační modifikace a formy histonů vazba interagujících proteinů TF, RNA pol., MBD, …

31. Úloha a projevy metylace DNA • dědičná (mitoticky a částečně i meioticky) modulace transkripce- genové exprese • - obranný mechanismus vůči invazní DNA (transpozóny) • - regulace genové exprese (ontogeneze, diferenciace a buněčná paměť, reakce na stres) • - parentální imprinting • modulace struktury chromatinu (příčina i následek) • - časování DNA replikace • - regulace homologní rekombinace (meiosa) • - definování hranic exon-intron • nástroj evoluce • - genomů polyploidních rostlin (rozsáhlé změny metylace) • - nových genů (mutageneze pseudogenů)

32. Metylace DNA u Arabidopsis Silná metylace v repetitivních heterochromatinových oblastech centromery Metylace v kódujících sekvencíchgenů – u více než 30 % exprimovaných genů (metylace především u genů se středně silnou expresí) Metylace v promotorech – u méně než 5 % genů (geny s vývojově a pletivově specifickou expresí)